Implication des jasmonates dans la réponse et l’acclimatation aux flexions chez le peuplier

2- Implication des jasmonates dans la réponse et l’acclimatation aux flexions chez le peuplier

2.1- Cinétique d’expression des gènes de biosynthèse et de régulation des jasmonates après une flexion

Afin de tester si la voie de signalisation des jasmonates est impliquée dans la réponse aux sollicitations mécaniques chez le peuplier, la cinétique d’expression des gènes de biosynthèse et de régulation des jasmonates suite à la flexion a été analysée en utilisant les mêmes plantes que celles décrites dans le paragraphe précédent (&1.1). Dans ce but, des alignements de séquence ont été réalisés entre les protéines identifiées chez Arabidopsis thaliana et la banque de données de Populus trichocarpa. Des amorces ont été dessinées dans les régions conservées de ces différentes protéines. Pour chaque couple d’amorce, le fragment d’ADN amplifié par Q-PCR a été séquencé pour confirmer sa spécificité. Comme le montre la figure 14 A., le niveau de transcrits des gènes étudiés de cette voie de biosynthèse (LOX3, AOC, OPR et JAR4) est modifié après une flexion. En effet, la quantité d’ARNs LOX3 est 8 fois supérieure à celle observée chez le témoin 30 min et 1 heure après la flexion. L’expression de LOX3 revient au niveau de base au bout de 3 heures. En ce qui concerne JAR4, son expression est induite plus tardivement (3 heures après la flexion) et diminue après 24 heures. De manière surprenante, deux pics d’accumulation d’ARNs sont observés pour les gènes AOC et OPR au cours de la cinétique. Pour ces deux gènes, un premier pic de faible intensité est observé dès 5 min après la sollicitation et le taux de transcrit revient au niveau de base au bout de 15 min. Puis, un deuxième pic d’expression de forte intensité du gène AOC est détecté 3 heures après la flexion, puis la quantité de transcrits diminue jusqu’à atteindre le niveau de base après 24 heures. Dans le cas du gène OPR, un deuxième pic d’expression de faible intensité et très transitoire est également observé 3 heures après la flexion (fig.14 A).

Figure 15 : Comparaison des cinétiques d’expression des gènes de biosynthèse et de régulation des jasmonates après une flexion ou deux flexions de la tige chez le peuplier.

La quantité relative des transcrits (Qr) de certains gènes de biosynthèse (LOX3 (A), AOC (C), OPR (D) et JAR4 (B)) et de régulation (JAZ5 (E) et MYC2 (F)) des jasmonates a été étudiée par PCR quantitative en temps réel. Pour chaque plante, la fraction fléchie de la tige (3 cm de longueur) a été prélevée 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 1h, 3h, 5h et 24h après la première flexion (1F) et la deuxième flexion (2F). L’intervalle entre deux flexions est de 24h. Des plantes non fléchies ont été utilisées comme témoins (T). Les barres d’erreur représentent l’écartype de la quantité relative des transcrits pour chaque temps de la cinétique pour 2 répétitions indépendantes de cette expérience. Les valeurs notées par des lettres différentes sont significativement différentes (test de Newman- Keuls P < 0.05).

Ces résultats montrent que l’ensemble des gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des jasmonates sont régulés suite à une sollicitation mécanique. Toutefois, les gènes AOC et OPR sont régulés plus précocement par un stress de type flexion que les gènes LOX3 et JAR4.

Concernant les gènes impliqués dans la régulation de la voie de biosynthèse des jasmonates, l’expression de JAZ3 et JAZ12 n’est pas régulée par la flexion alors que celle de JAZ5 est fortement induite dès 30 min après la flexion (fig.14 B). Ces résultats suggèrent que les deux isoformes JAZ3 et JAZ12 de la famille multigénique des gènes JAZ, ne semblent pas être impliqués dans la réponse à la flexion chez Populus tremula X alba. Au contraire, l’isoforme JAZ5, décrit comme un régulateur négatif de cette voie, est fortement régulé par ce type de sollicitation.

Comme le montre la figure 14 B, l’expression du facteur de transcription MYC2, régulateur positif de cette voie de signalisation, est induite après 15 min (un peu avant celle de JAZ5), atteint un maximum à 30 min et diminue au bout de 3 heures. Ces données indiquent que l’ensemble des gènes de la voie de signalisation des jasmonates pourraient être régulés par le stress mécanique chez le peuplier.

2.2- Etude de l’expression des gènes de biosynthèse et de régulation des jasmonates après des flexions répétées chez le peuplier

2.2.1- Comparaison de la cinétique de l’expression des gènes de biosynthèse et de régulation des jasmonates après une ou deux flexions

Afin d’étudier l’impact des flexions répétées sur l’expression des gènes de biosynthèse et de régulation des jasmonates, la cinétique d’accumulation des transcrits de LOX3, JAR4, AOC, OPR, JAZ5 et MYC2 dans la tige après une flexion a été comparée à celle après deux flexions. Dans cette expérience, la deuxième flexion est réalisée 24h00 après la première flexion. Pour tous ces gènes, la cinétique d’induction n’est pas modifiée mais le niveau d’expression est plus faible après la deuxième flexion en comparaison avec la première flexion (fig.15). Pour le gène LOX3 (fig.15 A), cette diminution du taux de transcrits est très forte et pour certains points de la cinétique, la quantité de transcrits est plus faible que celle observée chez le témoin n’ayant pas subi de sollicitation mécanique. Ces résultats pourraient suggérer une répression de l’expression de LOX3.

Figure 16 : Expression de LOX3 (A), JAZ5 (B) et MYC2 (C) après la deuxième flexion en fonction du délai entre les deux flexions. La quantité relative des transcrits (Qr) a été obtenue par PCR quantitative en temps réel. Pour chaque plante, la fraction de tige fléchie a été prélevée 30 min après la deuxième flexion. La deuxième flexion a été réalisée 3, 6, 12, 18 ou 24 heures après la première flexion. Les histogrammes colorés en vert foncé (1F) et en vert clair (24 h) proviennent d’une expérience indépendante (fig.12). Des plantes non fléchies ont été utilisées comme témoins (T). Les barres d’erreur représentent l’écartype de la quantité relative des transcrits mesurée sur 2 plantes. Les valeurs notées par des

lettres différentes sont significativement différentes (test de

2.2.2- Etude de l’expression des gènes de biosynthèse et de régulation des jasmonates en fonction du délai entre les deux flexions

Comme dans le cas du gène PtaZFP2, nous avons étudié si l’intervalle de temps entre les deux flexions avait un impact sur l’expression de ces gènes de la voie des jasmonates après la deuxième flexion. La deuxième flexion a donc été appliquée 3, 6, 12, 18 et 24 heures après la première flexion et les tiges ont été prélevées 30 min après la seconde flexion. Dans le cas du gène LOX3, quand la deuxième flexion a été appliquée 3 h après la première flexion, le taux d’ARNs est plus faible que celui observé après une seule flexion (fig.16 A). Toutefois, la quantité d’ARN LOX3 est encore plus faible si un intervalle de 18h00 s’est écoulé entre les deux flexions. Si on compare le niveau d’expression de JAZ5 après la deuxième flexion (en fonction du délai entre les deux flexions) avec celui obtenu après une flexion, on remarque que le niveau des transcrits est significativement différent lorsque le délai entre les deux flexions est de 6 heures (fig.16 B). Toutefois, l’expression du gène JAZ5 3h00 après la première flexion n’a pas atteint le niveau de base. Donc le taux de transcrits mesuré, si le délai entre les deux flexions est de 3h00, comprend les ARNs JAZ5 accumulés lors de la première flexion et ceux accumulés lors de la seconde sollicitation. Ainsi, la quantité de transcrits observée après la deuxième flexion lorsque le délai entre les deux flexions est de 3h00 correspond aux transcrits JAZ5 accumulés à la suite de la première et la deuxième flexion. Par contre, le niveau d’expression de MYC2 après la deuxième flexion est statistiquement différent de celui observé après une seule flexion uniquement si l’intervalle de temps entre les deux flexions est de 18h00 (fig.16 C).

3- Etude de l’acclimatation à des flexions répétées à travers des plantes transgéniques de