Etude de l’acclimatation à des flexions répétées à travers des plantes transgéniques de peuplier surexprimant le gène PtaZFP

3.1- Est-ce que PtaZFP2 régule l’expression des gènes de la voie de des jasmonates? Afin d’étudier si le gène PtaZFP2, codant pour un facteur de transcription de type C2H2, pourrait être impliqué dans la régulation des gènes de la voie des jasmonates, nous avons utilisé deux lignées transgéniques indépendantes de peupliers (A30 et A39) dans lesquelles l’expression du transgène PtaZFP2 est surexprimé après ajout d’œstradiol dans le milieu de culture.

Figure 17: Expression du transgène PtaZFP2 dans les lignées transgéniques de peuplier en absence de flexion.

La quantité relative des transcrits (Qr) de PtaZFP2 a été mesurée par PCR quantitative en temps réel. Les plantes ont subi un traitement hebdomadaire avec 5 µM de 17 β-œstradiol qui a été ajouté dans la solution nutritive. Les plantes n’ont subi aucune flexion (0F). Les lignées transgéniques (A39 et A30) surexprimant PtaZFP2 en présence de l’œstradiol ont été comparées avec la lignée sauvage (WT) de Populus tremula X alba. Les barres d’erreur représentent l’écartype de la quantité relative des transcrits mesurée sur 2 plantes. Les valeurs notées par des lettres différentes sont significativement différentes (test de Newman-Keuls P < 0.05).

Figure 18 : Cinétique d’expression des gènes de biosynthèse et de régulation des jasmonates chez des plantes transgéniques surexprimant PtaZFP2 en absence de flexion après un traitement au β-œstradiol.

La quantité relative des transcrits (Qr) des gènes de biosynthèse (LOX3 (A) et JAR4 (D)) et de régulation (JAZ5 (C) et MYC2 (B)) des jasmonates a été obtenue par PCR quantitative en temps réel. Le 17 β-œstradiol a été ajouté dans la solution nutritive à 5 µM finale. Les différents temps (T0, 1h, 3h, 6h, 9h, 12h, 24h et 48h) indiquent le temps de prélèvement des fractions des tiges après l’ajout de l’œstradiol. Les barres d’erreur représentent l’écartype de la quantité relative des transcrits mesurée sur 2 plantes. Les valeurs notées par des astérisques (*) sont significativement différentes du témoin (test de Newman-Keuls P < 0.05).

Comme le montre la figure 17 le niveau d’expression de PtaZFP2 chez des plantes sauvages non fléchies est très faible et presque nul. Cependant, en présence d’œstradiol et en absence de flexions, le niveau d’expression de PtaZFP2 est 100 fois supérieur à une plante sauvage chez la lignée A39 et 20 fois supérieur à celui d’une plante sauvage chez la lignée A30. Chez les peupliers transgéniques, en absence de flexion, l’expression observée de PtaZFP2 est due uniquement à l’expression du transgène et pas à l’expression du gène PtaZFP2 endogène.

Comme le montre la figure 18, le niveau d’expression des gènes LOX3, JAR4, JAZ5 et MYC2 a été mesuré différents temps après l’ajout de 17 β-œstradiol dans le milieu chez des plantes transgéniques A39 et chez des plantes sauvages. Aucune différence d’expression n’est observée entre les plantes A39 et les plantes sauvages pour le gène JAR4 (fig.18 D). Pour les gènes LOX3, MYC2 et JAZ5, aucune différence d’expression n’est observée entre les plantes transgéniques et les plantes sauvages excepté pour le point 1h de la cinétique (fig.18 A, B et C). Or, chez les plantes A39, la surexpression du transgène PtaZFP2 commence à augmenter seulement 3 heures après l’ajout d’œstradiol dans le milieu de culture (annexe 1). La surexpression de PtaZFP2 ne peut pas expliquer le pic de transcrits de ces gènes (fig.18 A, B et C). La quantité importante de transcrits de LOX3, MYC2 et JAZ5 observée 1 heure après le traitement œstradiol à la fois chez les plantes sauvages et chez les plantes transgéniques, pourrait être expliquée par l’application de l’œstradiol lui-même pouvant constituer un stress pour les plantes. Or, les gènes impliqués dans la biosynthèse des jasmonates sont connus comme des gènes de réponse à de nombreux stress. Le pic d’expression pourrait être du aussi à la manière d’appliquer l’œstradiol (agitation du milieu de culture autour des racines) pouvant constituer un stress pour les jeunes peupliers.

De ce fait, en absence de flexion, PtaZFP2 ne régule pas l’expression des gènes de la voie de biosynthèse des jasmonates (LOX3 et JAR4) ou des gènes régulant cette voie (JAZ5 et MYC2).

Dans un deuxième temps, nous avons étudié l’expression de ces mêmes gènes dans des plantes transgéniques A39 et A30 ayant subi une flexion de la tige ou deux flexions successives séparées de 24h00. Pour chaque plante, les flexions ont été contrôlées de manière à appliquer la même somme de déformations. Dans le cas où des flexions ont été appliquées, les portions fléchies des tiges ont été récoltées 30 min après la dernière flexion.

Figure 19 : Expression de LOX3, JAZ5 et MYC2 chez des lignées transgéniques de peuplier suexprimant le gène PtaZFP2 en présence des flexions.

Les quantités relatives des transcrits (Qr) ont été mesurées par PCR quantitative en temps réel. Les plantes ont subi un traitement hebdomadaire avec 5 µM de 17 β-œstradiol qui a été ajouté dans la solution nutritive. Pour les plantes fléchies 1 fois (1F) ou 2 fois (2F) séparées de 24 heures, la portion fléchie de la tige (3 cm de longueur) a été prélevée 30 min après la flexion. Les plantes non fléchies (0F) ont été utilisées comme témoins. Les lignées transgéniques indépendantes (A39 et A30) surexprimant PtaZFP2 en présence de l’œstradiol ont été comparées avec la lignée sauvage (WT) de Populus tremula X alba. Les barres d’erreur représentent l’écartype de la quantité relative des transcrits mesurée sur 2 plantes. Les valeurs notées par des lettres différentes sont significativement différentes (test de Newman-Keuls P < 0.05).

De manière surprenante, en absence de flexion, le niveau des transcrits des gènes LOX3 et JAZ5 chez les peupliers transgéniques A30 et A39 est plus faible que celui du sauvage (fig.19 A et B) alors que pour MYC2, aucune différence n’est observée entre les plantes sauvages et transgéniques (fig.19 C). Après une flexion, le niveau d’expression de tous les gènes testés augmente d’une manière importante par rapport aux plantes non fléchies mais la quantité de transcrits reste toujours plus faible dans les lignées A30 et A39 pour LOX3 (fig.19 A) et uniquement dans la lignée transgénique A39 pour JAZ5 et MYC2 (fig.19 B et C). Ces résultats suggèrent que la surexpression de PtaZFP2 engendre la répression de l’expression de LOX3 (chez A30 et A39), MYC2 et JAZ5 (chez A39 seulement où la surexpression du transgène PtaZFP2 est forte). Dans le cas où deux flexions successives ont été appliquées, l’induction de l’expression de LOX3 est plus faible que suite à une seule flexion pour le sauvage et les plantes A39 mais reste aussi élevée pour la plante A30 (fig.19 A). Pour les gènes MYC2 et JAZ5, l’induction de l’expression est plus faible que suite à une seule flexion pour les trois génotypes. Dans tous les cas, le niveau d’expression de ces gènes est plus faible dans les plantes transgéniques A39.

3.2- Etude de l’expression des gènes mécanosensibles à travers les plantes transgéniques

Des travaux précédents effectués au laboratoire avaient montré que les gènes mécanosensibles TCH2, TCH4 et ACS6 impliqués dans la voie de signalisation de réponse aux sollicitations n’étaient pas régulés par PtaZFP2 dans les plantes transgéniques A30 et A39 en absence de flexion. Nous avons donc voulu tester l’expression de ces gènes dans ces mêmes plantes en présence d’une ou deux flexions. De manière surprenante, comme le montre la figure 20 A, en absence de flexion, le niveau d’expression de PtaZFP2 endogène est plus faible chez les plantes transgéniques A30 et A39 que chez le sauvage. De plus, alors que la première flexion engendre une augmentation importante de son expression dans les plantes sauvages, l’expression est plus faible dans les plantes A39 et similaire aux plantes sauvages dans les plantes A30. Ainsi, en absence de flexion, l’expression de PtaZFP2 endogène a été réprimée par la surexpression de ce même gène. Après une flexion, cette répression est beaucoup plus intense mais uniquement chez la lignée A39, probablement car dans cette plante, le transgène PtaZFP2 est surexprimé plus fortement que dans les plantes A30.

Figure 20 : Expression des gènes mécanosensibles chez les lignées transgéniques de peuplier surexprimant PtaZFP2 en présence des flexions.

La quantité relative des transcrits (Qr) de PtaZFP2 endogène (A), ACS6 (B), TCH2 (C) et TCH4 (D) a été mesurée par PCR quantitative en temps réel. Les plantes ont subi un traitement hebdomadaire avec 5 µM de 17 β-œstradiol qui a été ajouté dans la solution nutritive. Pour les plantes fléchies 1 fois (1F) ou 2 fois (2F) séparées de 24 heures, la portion fléchie de la tige (3 cm de longueur) a été prélevée 30 min après la flexion. Les plantes non fléchies (0F) ont été utilisées comme témoins. Les lignées transgéniques (A39 et A30) surexprimant PtaZFP2 en présence de l’œstradiol ont été comparées avec la lignée sauvage (WT) de Populus tremula X

alba. Les barres d’erreur représentent l’écartype de la quantité relative des transcrits mesurée sur

2 plantes. Les valeurs notées par des lettres différentes sont significativement différentes (test de Newman-Keuls P < 0.05).

Ensuite, après la deuxième flexion, la quantité relative des transcrits de ce gène diminue par rapport à celle observée après une seule flexion sauf dans les plantes A30 (fig.20 A).

De même, les profils d’expression des gènes ACS6 et de TCH2 sont très semblables à ceux de PtaZFP2 endogène. En effet, en absence de flexion, le taux de transcrits est plus faible chez les plantes A30 et A39. Puis, après la première flexion, le taux d’induction est plus faible chez les deux lignées transgéniques. Après deux flexions successives, le niveau d’expression est plus faible dans toutes les lignées par rapport à celui atteint après une seule flexion sauf pour la lignée A30 où le niveau est identique pour TCH2 (fig.20 B). Donc, l’expression des gènes ACS6 et TCH2 pourraient être réprimés par PtaZFP2 en particulier si une flexion a été appliquée sur les tiges des peupliers.

Le niveau d’expression de TCH4 est presque nul en absence de flexion chez toutes les lignées (fig.20 D). Ensuite, après une flexion, l’accumulation de transcrits TCH4 due à la flexion est beaucoup plus faible dans les deux lignées transgéniques par rapport aux plantes témoins. Lorsque deux flexions successives sont appliquées, l’induction de TCH4 diminue dans toutes les lignées sauf pour les plantes A30 dans lesquelles la quantité de transcrits TCH4 est plus élevée que celle après une seule flexion (fig.20 D). Ainsi, l’expression de TCH4 est fortement réprimée en cas de la surexpression de PtaZFP2 en particulier si une flexion a été appliquée à la tige.

Discussion

1- Analyse moléculaire des réponses des plantes aux flexions multiples chez le peuplier