Implication du système neurotensinergique dans la prolifération cellulaire-mécanismes

3.1.3.1 Promotion de la prolifération cellulaire induite par le complexe NTS-NTSR1

Nos expériences précédentes ont montré que le complexe NTS-NTSR1 est un facteur favorisant la croissance tumorale. Afin de comprendre les mécanismes contribuant à ce phénomène, nous avons étudié la croissance cellulaire des lignées LNM-R, LNM-F, SINTS, SINTSR1 in vitro. Pour rappel, le statut d’expression NTS-NTSR1 est présenté dans le tableau 13.

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Tableau 13 : Statut d’expression NTS-NTSR1 dans les différentes lignées cellulaires

NTS NTSR1 LNM-35 + + LNM-R + + LNM-F - + R-SINTS - + R-SINTSR1 + -

Afin de confirmer le rôle de la NTS dans la croissance cellulaire, les cellules LNM-F, R-SINTS et R-R-SINTSR1 on été traitées par la NTS ou par son agoniste JMV449 faiblement dégradable pendant 5 jours. Plusieurs concentrations de JMV449 ou de NTS (de 10^-7 à 10^-10 M) ont été testées. La meilleure réponse a été observée pour la concentration 10^-8 M de JMV449 et de NTS avec une augmentation de la croissance cellulaire de 90% dans les LNM-F et de 60 % pour les R-SINTS traitées par rapport aux cellules non traitées. Par contre, aucune différence dans la prolifération n’a pas été observée lorsque les cellules R SINTSR1 traitées par la NTS ou le JMV449 (figure 44A).

En parallèle, dans le but d’étudier l’impact des régulations autocrines et paracrines à la NTS sur la croissance cellulaire, nous avons, comme dans les expériences in vivo, mélangé les cellules LNM-R et LNM-F. Nous avons choisi le pourcentage de 20/80 % de LNM-R/LNM-F car ce pourcentage correspond à la proportion des deux sous-populations rondes et aplatie, de la lignée parentale LNM-35. Tout d’abord, nous avons comparé le taux de croissance cellulaire des cellules LNM-R, et LNM-F et du mélange LNM-R/LNM-F-20/80 (R/F-20/80%). Le même nombre de cellules a été ensemencé pour les trois conditions à J0 et le taux de croissance est estimé après 72h (J3) dans culture à 0.1% de sérum. Dans ces conditions on observe que le mélange cellulaire présente une croissance cellulaire de 65% supérieure à celle des lignées LNM-R et LNM-F ensemencées seules (figure 44B).

La coopération entre les deux lignées cellulaires LNM-R et LNM-F observée dans les tumeurs a pu être retrouvé in vitro. Pour confirmer l’implication du système neurotensinergique dans la promotion de la croissance cellulaire du mélange R/F-20/80, nous avons fait une expérience en présence ou absence des inhibiteurs spécifiques qui ciblent l’activation du système neurotensinergique. Ainsi, l'inhibiteur spécifique des protéines G hétérotrimérique, le BIM46174, l'antagoniste spécifique de NTSR1, le SR4692 et un anticorps neutralisant anti

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NTS, inhibent totalement l’amplification de la croissance cellulaire observée dans le mélange (R/F-20/80) (figure 44C).

Ces données montre une contribution de la NTS dans la croissance cellulaire des cellules bronchiques et suggèrent qu’une communication intercellulaire, par l’intermédiaire de la régulation paracrine de NTS, s’installe et permettant la promotion de la croissance cellulaire.

(Figure 44) Complexe NTS-NTSR1 favorise la prolifération cellulaire. A) Ratio de nombre des cellules LNM-F, R-SINTS, et R-SINTSR1 traitées par NTS 10^-8M ou JMV449 10^-8M pendant 5j par rapport à leur nombre initial ensemencé. B) Ration de nombre des cellules LNM-R, LNM-F et leur mélange R/F-20/80 à 72h par rapport à leur nombre initiale ensemencé, nombre d’expériences =10. C) Comparaison de l’effet d’amplification de la croissance cellulaire dans le mélange R/F-20/80% à celui avec le traitement par BIM46174 (10^-6M), SR48692 (10^-6,M) ou par anticorps anti-NTS (1/200) pendant 48h

3.1.3.2 Propriétés prolifératives et anti-apoptotiques du couple NTS-NTSR1

Les résultats obtenus montrent que le couple NTS-NTSR1 favorise la croissance cellulaire. Cependant, il est décrit que la NTS agit sur la prolifération et la survie cellulaire dans des cellules cancéreuses de différentes origines. Nous avons donc souhaité caractériser ces effets dans les cellules Nous avons étudié, par la technique du FACS, l’apoptose et le cycle cellulaire dans les cellules LNM-R, LNM-F et du mélange R/F-20/80. L’étude de cycle

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cellulaire montre que le taux des cellules en phase S du mélange R/F-20/80 est de 12 % supérieur à celui des cellules LNM-F (figure 45A). En revanche, le pourcentage des cellules en phase G1 du mélange R/F-20/80 est 20 % inférieur à celui des cellules LNM-F (figure 45B). Ces données sont en faveur d'un effet de la NTS sur la prolifération cellulaire. La comparaison du taux des cellules en apoptose entre les LNM-R, LNM-F, et le mélange R/F-20/80% a montré que ce dernier présente un pourcentage des cellules apoptotiques 30% inférieur à celui des cellules LNM-F (figure 45C).

(Figure 45) Propriétés prolifératives et anti-apoptotiques de complexe NTS-NTSR1 étudiées par FACS. Taux des cellules LNM-R, LNM-F, et du mélange 20/80% en phase S (A) et G1(B) du cycle cellulaire, après 72h de l’encensement. (C) Taux des cellules LNM-R et le mélange cellulaire 20/80% en apoptose par rapport à celui dans les cellules LNM-F.

3.1.3.3 Voies de signalisation impliquées en aval du NTSR1

Les données de la littérature sur le rôle prolifératif de NTS sont riches et montrent que la NTS est capable d’activer plusieurs voies, en particulier la voie de protéine kinase C (PKC). D'autres effecteurs impliqués en aval de NTS sont le [Ca²⁺]i et Nos. Donc, afin d’examiner les voies de signalisations activées en aval du NTSR1 contribuant à l'amplification de la croissance cellulaire, nous avons utilisé des inhibiteurs pharmacologique. La figure 46 A montre que l'amplification de la croissance cellulaire du mélange R/F-20/80

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est inhibée par un inhibiteur de PKC, alors que les inhibiteurs de PKA et de NOs sont sans effets.

Parallèlement, nous avons étudié le rôle probable de PI3K et MAPK en utilisant les inhibiteurs de phosphoinositide 3-kinase PI3K (LY 294002 10^-7M), et de MAPK (PD98059 et U0126 10^-6M) (figure 46B). Le traitement des cellules par ces inhibiteurs aboli totalement l’amplification de la croissance cellulaire induite par NTS. Ces résultats renforcent ceux obtenus par le FACS et plaident en faveur d’ un rôle prolifératif et antiapoptotique de NTS.

(Figure 46) Voies de signalisation impliquées dans la croissance cellulaire en avale du NTSR1. A) Comparaison de l’effet d’amplification de la croissance cellulaire dans le mélange R/F-20/80 à celui avec le traitement par inhibiteur de PKA (H7 ; 10^-5 M), de PKC (GO6976 ; 10^-6 M) et de NOs (D-NAME/L-NAME ; 10^-5 M) pendant 48h. B) Comparaison de l’effet d’amplification de la croissance cellulaire dans le mélange R/F-20/80 à celui avec le traitement par inhibiteur de PI3K (LY 294002 10 -7

M), et de MAPK (PD98059 et U0126 10^-6M) pendant 48h