Immunothérapie par BCG :

Actuellement, l’immunothérapie la plus utilisée se pratique par instillation intra vésicale d’une solution contenant du bacille de Calmette Guérin (BCG ou

Mycobacterium bovis) par les voies naturelles sur des patients atteints d’une tumeur

superficielle de la vessie de plus haut grade ou rapidement récidivante. Ce traitement entraine une réduction significative de la récidive et de la progression

[217,218]

. En 1975, deKernion a rapporté le premier traitement d’une tumeur

vésicale métastatique, un mélanome malin, par BCG-thérapie locale. Cet engouement pour les immunothérapies des années 70 a amené les Dr Morales

puis Martinez-Pineiro en 1976 à tester l’effet prophylactique du BCG sur les

tumeurs superficielles de la vessie ^[219,220]. La première étude contrôlée confirmant l’efficacité du BCG a été rapportée par Lamm et al. en 1980 [221]

. Depuis lors, le traitement par instillation intra vésicale de BCG s’est avéré être l’agent thérapeutique le plus efficace pour traiter les tumeurs superficielles de la vessie, surtout pour les carcinomes in situ (Tis) ^[222]. Cette efficacité lui a valu d’être approuvé par l’organisme US Food and Drug Administration en 1990. Arbitrairement, il a été décidé de pratiquer ce traitement par 6 instillations intravésicales hebdomadaires. Le mode d’administration du traitement est depuis en perpétuelle optimisation, le mode idéal n’étant pas encore déterminé. L’immunothérapie au BCG a particulièrement amélioré le temps de survie sans récidive et a aussi réduit la progression, mais il reste toujours un sous-groupe de patients réfractaires pour qui le traitement au BCG n’amène qu’une perte de temps, n’ayant aucun effet sur la récidive ou la progression. Six études indépendantes, comprenant 585 patients au total, ont montré que la récidive était moins fréquente parmi les gens qui ont eu une résection et un traitement au BCG

86

par rapport à ceux qui n’ont eu qu’une résection (taux de récidive de 29% au lieu de 67%) ^[223].

L’infection par le BCG entraîne la desquamation des cellules superficielles de la vessie, tant normales que tumorales. Il est convenu dorénavant que l’activité antitumorale du BCG est dirigée par la réaction immunitaire locale non spécifique des cellules immunocompétentes ^[224]. Plusieurs aspects immunogéniques ont été étudiés après les instillations de BCG, comme l’infiltration de la paroi cellulaire par les cellules effectrices [225]

, l’implication des lymphocytes cytotoxiques [226]

, du complexe majeur d’histocompatibilité ou de l’expression des molécules d’adhésion sur les cellules urothéliales ^[227] ainsi que la sécrétion de cytokines. Aucun n’a pu être clairement impliqué dans l’activité antitumorale du BCG.

H. SURVEILLANCE

(voir annexe 6)^[228]

:

1. Tumeurs à faible risque :

Cystoscopie à trois, six et douze mois puis une fois par an pendant cinq ans après la première résection.

2. Tumeurs à risque intermédiaire :

Cystoscopie et cytologie à trois, six et douze mois puis une fois par an pendant quinze ans.

UIV en cas de récidive.

3. Tumeurs à haut risque :

Cystoscopie et cytologie tous les trois mois la première année, puis tous les six mois la deuxième année, puis une fois par an pendant quinze ans.

87

P

Pa_ar_rt_ti_ie_e p_pr_ra_at_ti_iq_qu_ue_e :_:

N

88

I

In_nt_tr_ro_od_du_uc_ct_ti_io_on_n :_:

O

89

Les tumeurs de vessie représentent un groupe hétérogène de tumeurs quant à la cancérogenèse, au pronostic et au traitement. Dans le traitement des lésions superficielles envahissant le chorion, la résection endoscopique est souvent incomplète malgré l’impression macroscopique de l’urologue : six semaines après le geste, des reliquats tumoraux sont observés dans 40% des cas

[229]

. Ainsi, la résection endoscopique est insuffisante à traiter une tumeur infiltrante : la cystectomie radicale est le traitement de référence de ces lésions, intervention dont les conséquences fonctionnelles sont importantes tant sur le plan de la sexualité, de la continence que de l’intégrité du schéma corporel. C’est un enjeu très important que de prendre la décision de la cystectomie au bon moment dans l’histoire naturelle d’une tumeur de vessie pour éviter au patient les très mauvaise qualités de survie que représentent une tumeur localement avancée inextirpable ou la survenue de métastases très symptomatiques comme les métastases osseuses.

Des algorithmes décisionnels sont maintenant de plus en plus admis dès le stade de tumeur superficielle. Mais des marqueurs d’agressivité au moment du diagnostic ou de l’opération demeurent nécessaires et font l’objet de recherches afin d’identifier très tôt les groupes de malades à risque de récidives, de progressions et de décès par cancer. C’est dans cette voie que notre étude essaie d’évaluer l’utilité en préopératoire d’un panel de marqueurs tumoraux sériques dans les tumeurs infiltrantes de la vessie.

Selon la littérature, l’intérêt des marqueurs tumoraux reste limité. Leur rôle est de confirmer un diagnostic clinique puis, après avoir sélectionné le traceur le plus spécifique de la lésion, de réaliser le suivi thérapeutique pour lequel il représente un facteur pronostique important. En outre, les marqueurs

90

tumoraux constituent fréquemment la première manifestation d’une récidive pouvant même, dans certains cas, précéder les symptômes cliniques, permettant ainsi une action thérapeutique plus rapide, mais ce dernier point demande encore une évaluation réelle de son intérêt clinique :

 Sur le plan diagnostique, un marqueur n’a d’intérêt que s’il est positif, en sachant qu’un résultat négatif ne permet en aucun cas d’exclure l’existence d’une tumeur ;

 Sur le plan thérapeutique, il convient de choisir le marqueur ayant la meilleure sensibilité ainsi que la meilleure spécificité.

 Sur le plan clinique, les valeurs de référence ou concentrations-seuils d’un marqueur doivent être définies avec précision. Les valeurs seuil optimisées sont déterminées à partir des courbes ROC (sensibilité/spécificité) pour chaque marqueur par l’étude de populations représentatives et en faisant varier les seuils décisionnels.

Notre travail vis deux objectifs :

1.

Un objectif principal : chercher à déterminer une valeur seuil pour les trois marqueurs tumoraux étudiés (ACE, CA19-9 et CA125) permettant de différencier entre les cancers infiltrants et les cancers superficiels de la vessie.

2.

Et un objectif secondaire : étudier les facteurs prédictifs d’un cancer infiltrant de la vessie.

91

P

92

1. Patients :

De Janvier 2008 à Février 2009, nous avons mené une étude prospective chez une cohorte de patients pris en charge par le service d’urologie de l’HMIMV pour tumeurs de vessie. Les patients étaient soit en première consultation ou venus pour une éventuelle récidive. Les données anamnestiques, cliniques et paracliniques étaient reportées sur une fiche d’inclusion établie en collaboration avec le service d’Urologie (page ci-après).

Cette étude est classée selon l’American College of Chest Physicians au niveau

de preuve 3 (annexe 7).

2. Méthodes :

2.1. ElecSys 2010 et Technologie ECL :

Le Laboratoire de Biochimie et Toxicologie de l’HMIMV dose les marqueurs tumoraux sur l’autoanalyseur ElecSys® 2010 Roche Hitachi version Rotor (figure 25 et 26). Ce dernier présente des caractéristiques préservant sa performance décrites au tableau 11 : L’ElecSys® 2010 présente un outil informatique nécessaire à l’organisation des analyses et à la gestion des informations analytiques, de la traçabilité et du contrôle qualité. Cela est atteint par simple positionnement des réactifs, calibrateurs et contrôles et les informations sont chargées automatiquement sans erreurs possibles. Toute information nécessaire à la réalisation des tests est intégrée par les codes à barres y compris les applications et les courbes de calibration. Après l’analyse d’un paramètre biochimique, l’automate conserve le résultat dans la disquette d’information.

93

Tableau 11: Caractéristiques instrumentales de l’ElecSys®2010. Cadence : 80 tests/heure en temps réel.

Volume échantillon par test : 10 à 50 l.

Capacité échantillons : 30 positions pour patients, contrôles et calibrateurs. Dimensions :  Largeur 120 cm,  Hauteur 56 cm,  Profondeur 73 cm,  Poids environ 170 kg. Système de mesure :

 Mesure intégrale d'un signal produit par ElectroChimiLuminescence (ECL).

Environnement :

 Température : 18 à 32°C,

 Ecart de température : Max. + ou - 2°C,  Humidité : 20 à 80%.

Réactifs-capacité :

 15 paramètres en ligne,  18 emplacements réactifs.

94

Figure 25 : ElecSys ®2010 fermé (Photo du Laboratoire de Biochimie et de

95

Figure 26 : ElecSys ®2010 ouvert (Photo du Laboratoire de Biochimie et de

Toxicologie de L’HMIMV).

4

9

8

3

2

5

6

7

1

96

Légende de la Figure 26 : Les principaux compartiments de l’ElecSys®2010. 1 : Diluants Pro-cell.

2 : Rotor de 30 positions, des tubes primaires ou secondaires, de tailles différentes, peuvent être utilisés sans adaptateurs. Il assure une adaptabilité de l’appareil.

3 : Positions permettant une gestion des urgences : ces positions donnent un accès immédiat pour les urgences qui sont traitées en priorité.

4 : Programmation par codes à barres : toutes les données sont intégrées dans le logiciel par les codes à barres mono- et bi-dimensionnels. Le système est programmé tout simplement par le positionnement sur l’automate des réactifs, contrôles et calibrateurs.

5 : Carrousel réactifs : comporte 18 positions thermostatées. Ceci comprend 15 réactifs ainsi que le diluant, les réactifs de prétraitement ou les réactifs annexes. L’ouverture et la fermeture des flacons de réactifs se fait automatiquement selon un mécanisme mécanique, évitant ainsi les évaporations et augmente la stabilité. 6 : Précision, la sélection du niveau de liquide et la vérification de la qualité de l’échantillon assurant une précision de prélèvement et une intégrité d’échantillon. L’homogénéisation des microparticules est automatique.

7 : Embouts de pipette à usage unique pour parer aux contaminations.

8 : Chargement des échantillons en continue : les résultats sont obtenus en 9 à 18 minutes.

9 : Ecran tactile couleur et le clavier de commande sont intuitifs et facilitent l’utilisation et la connaissance du statut de l’automate.

97

La technologie ECL ou ElectroChimiLuminescence est la méthode de mesure standardisée sur les automates d’immunologie de Roche Diagnostics ElecSys, gardant encore une longueur d’avance sur les techniques classiques de chimiluminescence.

L’ECL ou ECLIA pour ElectroChimiLuminescent Immuno-assay, est une forme de chimiluminescence, mais qui permet une plus grande amplification du signal. La réaction de chimiluminescence qui entraine l’émission de lumière est précédée par une réaction électrochimique ^[230].

Les acteurs de la réaction sont multiples. La figure 27 représente le principe d’ECL :

Figure 27 : Acteurs et déroulement de la réaction d’ECLIA [230]

98 Commentaire de la Figure 27 ^[230]:

1. L’Ag de l’échantillon forme un complexe sandwich avec l’Ac biotinylé et l’Ac couplé au sel de ruthénium.

2. Les microparticules tapissées de Streptavidine sont rajoutées au mélange réactionnel de la cellule et l’immuno-complexe se lie à la phase solide par l’interaction biotine-streptavidine.

3. Par aimantation, les microparticules tapissées d’immuno-complexes se déposent sur l’électrode. Les éléments non liés sont évacués de la cellule de mesure par le passage d’un tampon.

4. Par l’application d’une différence de potentiel, le cycle réactionnel peut s’enclencher : oxydation du sel de ruthénium et de la tripropylamine (TPA), présente en excès dans le tampon (radical cationique TPA++). En libérant un proton, le TPA instable cède son e- conférant au Ruthénium son état excité. En revenant à son état de base, le ruthénium émet un photon à la longueur d’onde de 620 nm. Il est ainsi disponible pour un nouveau cycle de

génération de lumière.

99

2.2. Principe de chaque test immunologique ^{[231, 232,233]}:

On peut résumer le principe de mesure de chacun des trois marqueurs tumoraux : ACE, CA19-9 et CA125 dans le tableau ci-dessous :

Tableau 12 : Principe de mesure pour chaque marqueur tumoral.

Test

Phase du Cycle ACE CA 19-9 CA 125 Méthode, Durée totale du cycle analytique Sandwich, 18 minutes 1^ère incubation

Une prise d’essai de :

10 l 10 l 20 l

est mise en présence d’un anticorps monoclonal anti-MT spécifique biotinylé et d’un anticorps polyclonal anti-ACE, monoclonal anti-CA 19-9 ou anti-CA 125 spécifique, marqué au ruthénium(a). Il se forme un « sandwich ».

2^ème incubation

Les microparticules tapissées de streptavidine sont ajoutées dans la cuvette réactionnelle. Le complexe immunologique est fixé à la phase solide par une liaison streptavidine-biotine.

Mélange réactionnel

Est transféré dans la cellule de mesure, les microparticules sont maintenues au niveau de l’électrode par un aimant. L’élimination de la fraction libre est effectuée par le passage de ProCell. Une différence de potentiel appliquée à l’électrode déclenche la production de luminescence qui est mesurée par un photomultiplicateur.

Résultats

Les résultats sont obtenus à l’aide d’une courbe de calibration. Celle-ci est générée, pour l’analyseur utilisé, par une calibration en 2 points et une courbe de référence mémorisée dans le code- barres du réactif.

100

MT : l’un des trois marqueurs tumoraux, ACE, CA 19-9 ou CA 125.

2.3.

Etape Pré- et Post-analytique

: 2.3.1. Prélèvement :

Le sang veineux (prise de sang au niveau du pli du coude), doit être recueilli sans anticoagulant, mais selon la technique de dosage ces types d’échantillons peuvent éventuellement être utilisés :

 Sérum recueilli sur tubes standards « tubes secs à bouchon rouge », qui contiennent un activateur de coagulation (billes en matériaux synthétiques) et nécessitants un délai de coagulation de 15-30 min avant de pouvoir les centrifuger, ou contenant un gel séparateur « tubes à bouchon rouge avec base jaune ». La vitesse minimale de centrifugation des tubes est de 1500 tours/min, pendant 10 min.

 Plasma recueilli sur héparinate de lithium ou sodium « tubes à bouchon vert », ou EDTA tripotassique « tubes à bouchon violet ». en cas d’utilisation de plasma recueilli sur héparinate de sodium, les résultats obtenus doivent être corrigés de + 10% pour l’ACE. La vitesse de centrifugation des tubes est de 2000 à 3000 tours/min, pendant 15min.

Pour le dosage des trois marqueurs objets de notre étude, la programmation et la périodicité du prélèvement sont fonction de la décision médico-chirurgicale, d’où le prélèvement doit être effectué avant chaque intervention chirurgicale que ce soit une RTUV, une cystectomie, une cysto-prostatectomie (partielle ou radicale) ou une pelvectomie. Les variations nycthémérales ne sont pas décrites, et le jeûne ne semble pas indispensable.

101

La quantité de sang à prélever doit être suffisante pour effectuer l’analyse et conserver une quantité aliquote dans la sérothèque conçue pour cette étude permettant une comparaison ou une vérification ultérieure.

Pour la conservation et le transport, les températures suivantes sont recommandées : +2 à +8°C pendant 24H après le prélèvement, puis à – 20°C.

2.3.2. Calibration :

Elle est réalisée à l’aide des calibrateurs Elecsys CEA CalSet, Elecsys CA19-9 CalSet et Elecsys CA125 II CalSet. La courbe de référence est adaptée à l’analyseur pour chaque test via le code-barres de chacun des trois réactifs respectivement, Elecsys CEA, Elecsys CA19-9 et Elecsys CA125.

La méthode a été standardisée par rapport :

 A la première préparation internationale : 1st IRP WHO référence 73/601 pour l’Elecsys CEA ;

 Au test Enzymun-Test CA19-9 pour l’Elecsys CA19-9 ;

 Au test Enzymun-Test CA 125 II, lui-même standardisé par rapport au test CA 125 II (RIA) de Fujirebio Diagnostics.

On doit effectuer une calibration systématique par lot en utilisant du réactif frais (ayant été enregistré depuis au maximum 24 heures sur l’analyseur). Une nouvelle calibration est recommandée après :

 1 mois (28 jours) pour un même lot de réactif,

 7 jours pour un même flacon de réactif resté sur l’analyseur.

Dans certaines situations par exemple, si les résultats du contrôle de qualité se situent en dehors des limites de confiance, la calibration devient une nécessité immédiate.

102 2.3.3. Contrôle de Qualité :

Sont utilisés pour le contrôle de qualité, l’Elecsys PreciControl Tumor Marker 1 et 2 pour les trois réactifs. Il est recommandé de doser les sérums de contrôle en

simple au moins une fois toutes les 24 heures pendant une routine, pour chaque nouveau coffret et lors d’une calibration.

2.3.4. Conservation et Stabilité des réactifs :

Les coffrets Elecsys CEA, CA19-9 et CA125 doivent être rangés en position verticale, de manière à ce que toutes les microparticules soient rassemblées lors de l’homogénéisation qui précède l’analyse. Conservés entre 2 et 8°C, ils sont stables jusqu’à la date de péremption indiquée avant ouverture.

Après ouverture, les coffrets peuvent être utilisés pendant 12 semaines mais conservés après utilisation entre 2 et 8°C.

A bord de l’analyseur Elecsys 2010®, ils sont stables pendant 6 semaines pour les coffrets Elecsys CEA et Elecsys CA125 II, et 8 semaines pour le coffret Elecsys CA19-9.

2.3.5. Réalisation du test :

L’analyseur effectue automatiquement l’homogénéisation des microparticules. Avant le chargement des coffrets, il faut amener les réactifs réfrigérés à environ 20°C et les placer dans le plateau des réactifs de l’Elecsys 2010® thermostaté à 20°C en évitant la formation de mousse. L’automate gère le contrôle de la température, l’ouverture et la fermeture des flacons. Les coffrets de réactifs doivent être refermés puis replacés au réfrigérateur après la série de dosage. L’analyseur calcule automatiquement la concentration en analyte de chaque échantillon et les résultats sont exprimés aux choix en :

103

o ng/ml ou en g/l pour l’ACE, avec 1ng/ml d’ACE correspond à 16,9 mUI/ml ;

o U/ml ou en kU/l pour le CA 19-9 ; o U/ml, en U/l ou en kU/l.

2.3.6. Limites d’utilisation et Interférences ^{[231, 232,233]}:

Test

Interférences

ACE CA 19-9 CA 125

Test non influencé par

Ictère (bilirubine < 1129 mol/l ou < 66 mg/dl)

Hémolyse (Hb< 1,4 ou < 2,2g/dl) ^{Hb< 2,0 ou <3,2g/dl}

Lipémie (intralipid<1500 mg/dl) Intralipid <2000mg/dl

Biotine (<491 nmol/l ou <120 ng/ml)

<100ng/ml ^{<143 nmol/l ou} <35 ng/ml

Facteur rhumatoïde jusqu’à 1500UI/ml jusqu’à 1200UI/ml

Effet crochet n’est pas observé jusqu’à

200 000 ng d’ACE/ml 500 000 U/ml 50 000 U de CA125/ml Critère d’acceptabilité : recouvrement ± 10% de la valeur initiale ± 15% de la valeur initiale ± 10% de la valeur initiale Médicaments fréquemment administrés :

in vitro

Sur

27

médicaments aucune influence n’a été observée Sur

26

médicaments aucune influence n’a été observée Sur

27

médicaments aucune influence n’a été observée

104

Il est recommandé d’effectuer le prélèvement de l’échantillon au moins 8heures après la dernière administration, chez les patients traités par des dose de biotine (> 5mg/jour). Pour minimiser tout ces effets, le test comporte des additifs.

2.3.7. Domaine de mesure et dilution des échantillons :

Test

ACE CA 19-9 CA 125

Domaine de

mesure 0,200-1000 ng/ml 0,600-1000 U/ml 0,600-5000 U/ml Ou jusqu’à 50 000 ng/ml pour les échantillons dilués (au 1/50) 10 000 ng/ml pour les échantillons dilués (au 1/10^e) 25 000 ng/ml pour les échantillons dilués (au 1/5^e)

La dilution des échantillons est faite avec le diluant Elecsys Diluent Universal, pour les échantillons présentant une concentration au-dessus du domaine de mesure.

105

2.3.8. Valeurs de référence, Sensibilité analytique et Spécificité analytique : Test V. réf, Se et Sp ACE CA 19-9 CA 125 Valeur de référence 3,40 ng/ml 39,00 U/ml 35,00 U/ml Sensibilité analytique 0,20 ng/ml < 0,60 U/ml 0,60 U/ml Spécificité analytique Ac monoclonaux utilisés présentent les réactions croisées suivantes : NCA1< 0,7%, NCA2 72%. Et réactions non observées ni avec α1-glycoprotéine acide ni avec l’AFP

Méthode utilise l’Ac monoclonal 1116-NS-19-9 disponible uniquement auprès de Fujirebio Diagnostics Ac monoclonaux utilisés M11 et OC 125, disponible uniquement auprès de Fujirebio Diagnostics

Dans le document Évaluation préopératoire des marqueurs tumoraux sériques : ace, ca19-9 et ca125 dans les tumeurs infiltrant le muscle vésical (étude prospective-HMIMV) (Page 85-105)