Immunofluorescence

Afin de déterminer le site d'injection du vecteur viral ainsi que l'étendue de son expression, les coupes de cerveaux ont subi un double marquage d'immunofluorescence GFP/4'.6- diamidino-2-phénylindole (DAPI) avant d'être observées sous un microscope à fluorescence. En résumé, les coupes ont d'abord été préincubées dans une solution de blocage composée d'albumine de sérum bovin (BSA) 5%, de triton 0.3% et de tampon phosphate salin (PBS) pendant 1h à température pièce. Suite au blocage, les coupes furent lavées au PBS et incubées pendant une nuit à 4°C dans l'anticorps primaire anti-GFP de lapin (1:1000, Invitrogen). Après 3 lavages au PBS, il y a eu incubation dans l'anticorps secondaire Alexa Fluor 488 (1:500, Invitrogen) pendant 1h à température pièce suivi du marquage au DAPI (1:1000, Invitrogen) pendant 5 min à température pièce. Les sections ont ensuite été montées sur lame et recouvertes avec du « PermaFluor Aqueous Mounting Medium » (Thermo Scientific).

2.11 Immunohistochimie

Deux séries de sections de cerveaux ont été utilisées pour des tests d'immunohistochimie. Une première afin de marquer la tyrosine hydroxylase (TH) pour vérifier la lésion dopaminergique et une deuxième pour mesurer le niveau de Leu-ENK. Dans les deux cas, les sections ont d'abord été bloquées dans une solution contenant du BSA 5%, du Triton X- 100 0.3% et du sérum normal de chèvre (NGS) 10% dans du PBS pendant 1h à température pièce. Après un lavage au PBS, elles ont été incubées dans l'anticorps primaire (anti-TH de lapin, 1:5000, Pel-Freez; anti Leu-ENK, 1:10000, ImStar) dilué dans du PBS contenant 2% de BSA, 0.1% de Triton X-100 et 2% de NGS pendant une nuit à 4°C. Après 3 lavages au PBS, elles ont été incubées dans une solution d'IgG de chèvre anti-lapin biotinylaté (1:400, Jackson ImmunoResearch) pendant 1h à température pièce puis dans une solution de PBS contenant le complexe avidine-biotine peroxydase (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories) pendant 1h à température pièce. Finalement, la réaction fut développée dans une solution de 3,3′-diaminobenzidine (DAB) (Sigma) et 0.1% de peroxyde d'hydrogène à 30% pendant 15 minutes à température pièce. Les sections furent ensuite montées sur lames

et séchées à l'air, pour ensuite être déshydratées dans des concentrations croissantes d'éthanol (70, 90 et 100%), nettoyées au xylène et recouvertes avec du DPX. Elles ont ensuite été prises en photos et quantifiées par densitométrie optique.

2.12 Hybridation in situ

L'ARNm de pENK et pDYN ont été marqués via des hybridations in situ sous condition sans RNase. Pour pENK, les sections ont été hybridées avec des sondes ARNc radiolabellées au [35_{S]UTP. La sonde pour pENK (935 pb, du nucléotide -104 à 830) fut} générée à partir d'ADNc de rat (Yoshikawa et al., 1984; Poulin et al., 2013). Le montage de l'ADNc de pENK fut linéarisé avec l'enzyme de restriction EcoR1 et la sonde antisens fut synthétisée avec [35_{S]UTP et la polymérase à ARN T7. Pour pDYN, la sonde a été générée} à partir de l'ADNc de souris (Civelli et al., 1985) par la Plateforme d'Outils Moléculaires. L'ADNc de pDYN fut linéarisé avec l'enzyme de restriction BamHI et les sondes antisens ont été synthétisées avec [35_{S]UTP et la polymérase à ARN T7 et SP6, respectivement.} En résumé, la technique d'hybridation a été exécutée de la manière qui suit. Les sections ont d'abord été montées sur lames et séchées à l'air. Ensuite, elles ont été fixées dans une solution de PFA 4% puis lavées dans du PBS et incubées pendant 20 min dans une solution de protéinase K/PBS (125 μl/250 ml). Suivant un lavage dans du PBS et du ddH20, les sections ont été incubées pendant 10 minutes dans une solution d'acétique anhydride 0.25% dans du triéthanolamine (TEA) 2%. Ensuite, un lavage a été fait pendant 5 minutes dans du citrate de salin/sodium (SSC) 2X. La sonde a été synthétisée de la manière suivante : 1) préparation du mélange réactionnel; 2) incubation pendant 1h30-2h à 37°C; 3) ajout de 1 μl de Dnase (10 U/ μl) et incubation pendant 10 min à 37°C; 4) ajout de 5 μl 0,5 M de EDTA pH8; 5) ajout de 19 μl de tampon ribosonde; 6) purification de la sonde sur colonne G50 MiniQuick spinRNA (Roche). L'hybridation in situ a été effectuée pendant une nuit à 57°C (pENK) ou 58°C (pDYN) en utilisant la solution d'hybridation contenant de la formamide à 50%, du tRNA (5%), du DTT (1%) et la sonde purifiée. Le lendemain, les lames ont été immergées dans du SSC 4X afin de décoller les lamelles et de nettoyer la solution d'hybridation. Par la suite, elles ont été placées dans une solution de RNase pendant 1h.

Plusieurs lavages à des concentrations décroissantes de SSC ont été effectués subséquemment. Les lames furent ensuite déshydratées dans de l'éthanol à 30, 60 et 100% (2 min dans chaque solution) et séchées à l'air avant d'être exposées à des films sensibles à la radioactivité (Biomax MR, Kodak) avec des lames standard 14_{C (ARC-146A) pendant} 42h (pENK) ou 48h (pDYN). Les films ont ensuite été photographiés à l'aide d'une caméra et les images furent analysées à l'aide du logiciel ImageJ, en normalisant la densité optique avec le corps calleux comme référence de l'activité de fond.

2.13 Analyses statistiques

L'analyse statistique des données a été effectuée avec une ANOVA à une direction suivie d'une analyse post hoc avec le test de Bonferroni ou d'un test de t. Le logiciel ayant été utilisé est Prism. Les résultats sont présentés comme les moyennes +/- les erreurs types de la moyenne (SEM). Une valeur de P < 0.05 a été considérée significative pour tous les tests

Chapitre 3 :

Résultats

3.1 Activité locomotrice

L'activité locomotrice des souris a été mesurée à trois moments différents afin de vérifier l'impact des injections de 6-OHDA et des AAV (Figure 7). Au début du protocole (pré-op), il n'y avait aucune différence au niveau de la distance parcourue entre les groupes (F4,27 = 0.097, P = 0.98). Il n'y avait également aucune différence entre les groupes aux temps post 6-OHDA (F4,27 = 0.31, P = 0.87) et post AAV (F4,27 = 1.39, P = 0.27). Cependant, des différences significatives ont été observées pour chacun des groupes entre le temps pré-op et les autres temps (test de t: 6-OHDA: t(4) = 5.75, P < 0.01; ANOVA: NSI: F2,14 = 12.09, P < 0.01; Saline: F2,17 = 12.02, P < 0.001; GFP: F2,20 = 13.55, P < 0.001; pENK: F2,23 = 19.97, P < 0.001).