I.3 Application à la détection de molécules d’intérêt biologique
I.3.2 Immunodosages multiplexés par FRET
Parmi les différentes méthodes de détection de biomolécules, la technique d’immunodosage est particulièrement répandue. Il s’agit de tests reposant sur la capacité d’un anticorps à reconnaître et à se lier de façon spécifique à une molécule cible, souvent un antigène. Depuis la réalisation du premier dosage immunologique de l’insuline humaine dans le plasma par Yalow et Berson en 1959 [74], les techniques d’immunodosages ont considérablement évolué, et se présentent aujourd’hui sous de nombreux formats en fonction de l’application recherchée [75].
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Parmi ces différents types d’immunodosages, on peut s’intéresser en particulier aux dosages multiplexés par FRET, qui permettent la détection simultanée de plusieurs molécules d’intérêt. Ainsi, Geissler et al. présentent en 2012 un biocapteur optique basé sur le FRET pour la détection multiplexée de cinq colorants organiques accepteurs combinés à un complexe de terbium donneur [76]. La détection par spectroscopie résolue en temps, le choix des filtres optiques et la correction des interférences spectrales (spectral crosstalk) permet une réduction efficace du bruit, et donne la possibilité d’application du biocapteur à la détection simultanée de cinq marqueurs tumoraux dans un échantillon de sérum humain (Figure I.26).
Figure I.26. Détection multiplexée par spectroscopie résolue en temps par FRET. En a, spectres de
luminescence du terbium donneur (en noir) et des colorants accepteurs, et spectres de transmission des filtres optiques passe-bande utilisés pour la détection multiplexée (rayures). En b, immunodosage pour la détection de cinq marqueurs tumoraux du cancer du poumon. Images extraites de la référence [76].
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En utilisant ce même principe de détection multiplexée, Qiu et al. réalisent le dosage simultané des récepteurs de facteurs de croissance épidermique EGFR et HER2, par FRET depuis des complexes de terbium donneurs vers des quantum dots accepteurs [77]. La dérégulation de ces deux récepteurs étant observée dans de nombreux cancers, notamment du poumon et du sein, leur détection duplexée pourrait constituer un outil diagnostic important dans le cadre de la thérapie personnalisée du cancer. La Figure I.27 présente le schéma de l’étude systématique réalisée pour la détection duplexée des récepteurs EGFR et HER2.
Figure I.27. Schéma du principe de détection duplexée par FRET des récepteurs EGFR et HER2.
Différentes formes d’anticorps (IgG, Fab, VHH) marquées avec du terbium ou des quantum dots
permettent la réalisation de plusieurs combinaisons d’immunodosages. Images extraites de la référence [77].
Il est important de noter qu’outre ces immunodosages en solution, des dosages multiplexés par FRET existent aussi en phase solide. Les biocapteurs développés par
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Kim et al. ou bien Algar et al. (qui ne sont donc pas des immunodosages à proprement parler, puisqu’ils ne reposent pas sur l’utilisation d’anticorps) en sont des exemples importants. Ainsi, Kim et al. réalisent un dosage multiplexé de protéases et de leur inhibition par transfert d’énergie avec comme donneurs différents quantum dots et comme accepteurs des nanoparticules d’or immobilisées sur une surface de verre [78] (Figure I.28). Les nanoparticules d’or décorées d’un peptide, substrat de la protéase, sont conjuguées à la surface des quantum dots à l’aide de liaisons biotine – streptavidine. Dans cette configuration, la luminescence des quantum dots est diminuée (quenching) par les nanoparticules d’or. La mise en présence du nanoconjugué avec la protéase provoque la coupure du peptide et la restauration de la luminescence des quantum dots.
Figure I.28. Schéma du principe de dosage des protéases par détection de transfert d’énergie entre
des quantum dots (QD) donneurs et des nanoparticules d’or (AuNP) comme accepteurs, greffées sur une surface de verre. Les quantum dots et les nanoparticules d’or sont liés par une courte séquence peptidique, substrat de la protéase. Leur mise en présence avec la protéase provoque la capture du peptide et la luminescence des QDs. Inversement, la protéase et son inhibiteur ne permettent pas de couper le peptide et l’extinction (quenching) entre les nanoparticules d’or et les QDs est maintenue. Image extraite de la référence [78].
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De leur côté, Algar et al. développent un dosage multiplexé en phase solide de l’hybridation d’acides nucléiques [79]. Ils utilisent pour ce faire le phénomène de FRET entre des quantum dots de CdSe/ZnS donneurs et des colorants organiques accepteurs. Les quantum dots de CdSe/ZnS verts (λPL = 530 nm) et rouges (λPL = 622
nm) sont immobilisés à la surface de fibres optiques de silice par utilisation de silanes, et des oligonucléotides biotinylés simple brin sont ajoutés à la surface par reconnaissance de neutravidine (NA). Les oligonucléotides complémentaires sont marqués avec des colorants organiques Cy3 ou Alexa Fluor 647. L’hybridation de ces oligonucléotides marqués avec les sondes en présence implique la proximité nécessaire au phénomène de FRET (Figure I.29).
Figure I.29. Schéma du principe de dosage en phase solide pour l’observation du phénomène d’hybridation. En a, dosage direct par FRET d’un QD vert (gQD) vers le colorant Cy3. En b, le marquage de la cible est empêché à l’aide d’un dosage de type sandwich. En c, dosage direct par FRET d’un QD rouge (rQD) vers le colorant Alexa Fluor 647 (A647). Les oligonucléotides biotinylés reconnaissent les neutravidines (NA) accrochées à la surface. L’utilisation combinée de QDs verts et rouges et de deux sondes d’oligonucléotides permet la réalisation d’un dosage multiplexé. Image extraite de la référence [79].
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Les études présentées dans ce chapitre d’état de l’art montrent l’importance d’un système de détection adapté aux caractéristiques de la molécule ou du processus d’intérêt. Dans ces conditions, il n’est pas raisonnable d’affirmer qu’un biocapteur sera toujours plus performant qu’un autre. C’est dans ce contexte que s’inscrit le projet µFRET, qui vise à réaliser un biocapteur en phase solide en conditions microfluidiques pour l’immunodosage multiplexé par FRET de molécules d’intérêt biologique. L’idée de ce projet est de réaliser une étude comparative approfondie de différents types d’immunodosages (en solution ou en phase solide, homogène ou hétérogène, pleine plaque ou en conditions microfluidiques) en termes de sensibilité, spécificité, volume, ou encore coût. Le travail présenté dans les chapitres IV et V de ce manuscrit de thèse s’inscrit dans le cadre du projet µFRET. Le développement et la caractérisation du dispositif fonctionnalisé devant servir à cette étude y sont présentés, puis le projet et les résultats préliminaires de l’étude sont explicités.
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