Etude quantitative de la fluorescence des substrats Al-SiO

fonctionnalisés

Dans l’optique d’extraire les informations nécessaires à l’établissement d’un biocapteur reposant sur la technique de FRET sur les échantillons d’aluminium recouverts de silice, j’ai réalisé une étude approfondie de l’intensité de fluorescence sur les structures.

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Les images obtenues en microscopie optique présentées en Figure II.17 montrent les substrats Al-SiO2 fonctionnalisés (Al-SiO2 + APTES + ATTO 647N, image

a.) ainsi que les contrôles associés : Al-SiO2 non silanisé (Al-SiO2 + ATTO 647N,

image b.), SiO2 fonctionnalisée (SiO2 + APTES + ATTO 647N, image c.) et Al

fonctionnalisé (Al + ATTO 647N, image d.).

Figure II.17. Images de fluorescence (après soustraction du bruit) des substrats Al-SiO2 + APTES +

ATTO 647N (a), Al-SiO2 + ATTO 647N (b), SiO2 + APTES + ATTO 647N (c) et Al + APTES + ATTO

647N (d). Les images sont représentées en fausses couleurs de 0 à 200 coups du bleu vers le rouge (échelle de couleur JET sur Icy). L’échelle représente 50 µm, et l’image mesure 1400 x 1400 pixels.

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Ces images, qui représentent une zone d’une seule structure, permettent déjà de valider la fonctionnalisation réussie des substrats Al-SiO2 par la silanisation à

l’APTES et le greffage consécutif des colorants ATTO 647N NHS (image a.). On peut également voir qu’un substrat non silanisé qui a subi un protocole de greffage des colorants ne présente pas de fluorescence (image b.), ce qui confirme d’une part la nécessité de l’étape de silanisation dans le protocole de fonctionnalisation, et d’autre part l’absence d’adsorption non spécifique pour un échantillon nettoyé par plasma O2.

L’intensité de fluorescence d’un substrat de silice (sans couche d’aluminium sous- jacente) fonctionnalisé (image c.) apparaît similaire à celle d’un substrat Al-SiO2

fonctionnalisé, laissant supposer une absence d’extinction (quenching) de la fluorescence qui pourrait être due à l’aluminium. Finalement, un substrat d’aluminium seul (sans couche de silice) fonctionnalisé (image d.) semble présenter une intensité de fluorescence inférieure à celle d’un substrat Al-SiO2 fonctionnalisé, indiquant

l’importance de la couche de silice pour une silanisation contrôlée et optimale.

Afin de corroborer ces premières conclusions, j’ai réalisé une étude quantitative de l’intensité de fluorescence en considérant plusieurs zones d’intérêt sur plusieurs échantillons du même type. J’ai pour cela utilisé la procédure de traitement d’images décrite précédemment.

J’ai tout d’abord cherché à justifier l’importance du traitement par plasma oxygène dans le protocole de fonctionnalisation. Pour cela, j’ai considéré chaque type d’échantillon, Al-SiO2, Al et SiO2. Chaque substrat a été nettoyé à l’acétone et à

l’isopropanol, puis séché à l’azote. Il a ensuite subi ou non un traitement par plasma oxygène, puis une goutte de 20 µL du colorant ATTO 647N NHS à 2 mg/mL y a été déposée pendant 1 heure. L’échantillon a finalement été rincé à l’eau déminéralisée et séché à l’air. Les intensités de fluorescence obtenues pour ces échantillons contrôles sont présentées dans le Tableau II.2.

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Tableau II.2. Intensité de fluorescence pour chaque type d’échantillon non silanisé

après protocole de conjugaison avec l’ATTO 647N

Type d’échantillon[a] Traitement par plasma O2 Intensité moyenne (coups)[b] Al-SiO2 oui 9 ± 7 Al-SiO2 non 57 ± 16 Al oui 4 ± 5 Al non 11 ± 8 SiO2 oui 13 ± 8 SiO2 non 118 ± 27

[a] _{Tous les échantillons sont incubés avec une goutte de 20 µL d’ATTO 647N NHS à 2 mg/mL. Le bruit}

soustrait est mesuré sur un échantillon du même type sans plasma O2 ni silanisation ni conjugaison

avec le colorant. [b] _{Intensité moyenne de fluorescence après traitement (soustraction du bruit,}

application du masque visant à s’affranchir des agrégats) pour environ 3x106_±1x104 _{pixels par ROI. Les}

erreurs ont été calculées sur les intensités des différents ROIs. Pour ces échantillons contrôles, trois à cinq ROIs ont été considérés par échantillon (pour 1 échantillon pour Al-SiO2 et deux échantillons pour

Al et SiO2). Ces mesures ont également été réalisées sur des échantillons Al-SiO2 pour 0,5 mg/mL

d’ATTO 647N NHS, ce qui correspond au maximum d’intensité de la Figure III.1 (chapitre III) ; ces mesures ont donné des résultats similaires, à savoir 8±7 avec traitement par plasma O2 et 77±18 sans

traitement.

Ces mesures permettent de constater que sans traitement par plasma oxygène, les valeurs d’intensité de fluorescence sont élevées et assez aléatoires, ce qui est certainement dû à l’adsorption non spécifique et non contrôlée du colorant sur les différentes surfaces. Les substrats traités par plasma O2 présentent eux des valeurs

d’intensité de fluorescence basses et peu variables, comme attendu pour ces échantillons de contrôle. Le traitement par plasma oxygène est donc une étape de nettoyage nécessaire dans le protocole de fonctionnalisation.

J’ai également réalisé l’étude de l’intensité de fluorescence sur les trois types d’échantillons – Al-SiO2, Al et SiO2 – fonctionnalisés. Chaque substrat a été nettoyé à

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l’acétone et à l’isopropanol, puis séché à l’azote. Il a ensuite été traité par plasma oxygène, silanisé par l’APTES, puis une goutte de 20 µL du colorant ATTO 647N NHS à 1 mg/mL y a été déposée pendant 1 heure. L’échantillon a finalement été rincé à l’eau déminéralisée et séché à l’air comprimé. Les intensités de fluorescence obtenues pour ces échantillons fonctionnalisés sont présentées dans le Tableau II.3.

Tableau II.3. Intensité moyenne de fluorescence pour chaque type d’échantillon

fonctionnalisé Type d’échantillon[a] Traitement par plasma O2 Intensité moyenne (coups)[b]

Al-SiO2-APTES oui 54 ± 17

Al-APTES oui 30 ± 15

SiO2-APTES oui 49 ± 14

[a] _{Tous les échantillons sont incubés avec une goutte de 20 µL d’ATTO 647N NHS à 1 mg/mL. Le bruit}

soustrait est mesuré sur un échantillon du même type sans plasma O2 ni silanisation ni conjugaison

avec le colorant. [b] _{Intensité moyenne de fluorescence après traitement (soustraction du bruit,}

application du masque visant à s’affranchir des agrégats) pour environ 3x106_±1x104 _{pixels par ROI. Les}

erreurs ont été calculées sur les intensités des différents ROIs. Pour ces échantillons fonctionnalisés, 3 ROIs ont été considérés.

La première ligne de ce tableau permet de valider la fonctionnalisation des substrats Al-SiO2 par l’APTES et l’ATTO 647N NHS. En effet, l’intensité moyenne est

de 54 ± 17 coups, ce qui est à comparer à l’intensité d’un échantillon contrôle de 9 ± 7 coups (Tableau II.2, première ligne).

En outre, les substrats d’aluminium seul présentent une intensité de fluorescence inférieure (30 ± 15) à ceux recouverts d’une couche de silice (54 ± 17), ce qui confirme l’importance de la couche de silice pour une fonctionnalisation contrôlée et optimale.

On constate également que les échantillons de silice seule SiO2 présentent une

intensité de fluorescence similaire à celle des échantillons d’aluminium recouverts de silice Al-SiO2 : 49 ± 14 coups pour SiO2 contre 54 ± 17 coups pour Al-SiO2. Ceci

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indique que la couche d’aluminium sous-jacente n’implique pas d’extinction (quenching) de la fluorescence des ATTO 647N.

Finalement, nous avons pu valider le greffage des colorants organiques ATTO 647N NHS aux aminosilanes par une étude quantitative de l’intensité de fluorescence. Ceci a nécessité la mise en place d’une procédure de traitement d’images permettant de s’affranchir de la fluorescence des agrégats. Nous avons également pu montrer l’importance du traitement par plasma oxygène dans le nettoyage des surfaces, ainsi que la nécessité du revêtement de silice pour une fonctionnalisation contrôlée et optimale. En outre, nous avons pu observer que la couche d’aluminium n’implique pas d’extinction de la fluorescence des ATTO 647N.