Deux types de protocoles ont été développés :
- immunisation in vitro sur une coculture cellules dendritiques/cellules dépourvues de monocytes et de NK (Cellules monocytes-/NK-)
- immunisation in vitro sur un ensemble de PBMCs sans NK dont les monocytes ont été maturés en cellules dendritiques.
La plupart des expériences (sauf exception précisée dans le texte) sont réalisées en milieu RPMI-1640 1X avec 10 % SVF décomplémenté, 2 mM L-Glutamine, 50 µ g/ml Pénicilline/Streptomycine et supplémenté avec 50 µM 5 Mercaptoéthanol, que nous appellerons milieu de culture.
5.1.1 Coculture Cellules dendritiques/PBMCs dépourvues de monocytes et de
NK
Ce type d’immunisation se déroule en plusieurs étapes et sur une période de temps de 15 à 20 jours.
A J0 : Les monocytes purifiés à partir des PBMCs sont mis en culture pendant 6 jours avec du GM-CSF 25 ng/ml (10 µl d’une solution mère à 2,5 µg/ml sont ajoutés dans les puits de volume final 1 ml) et de l’IL-4 50 ng/ml (10 µl d’une solution mère à 5 µg/ml sont ajoutés dans les puits de volume final 1 ml), cytokines permettant la maturation des monocytes en cellules dendritiques. En parallèle, les cellules monocytes-/NK- sont cultivées pendant 6 jours à 37°C, sous atmosphère humide à 5% de CO2.
A J6 : 1) Un aliquot de monocytes traités par GM-CSF et par IL-4 est utilisé en cytométrie en flux pour évaluer la différenciation des monocytes en cellules dendritiques. Un aliquot des cellules monocytes-/NK- est également marqué. Les différents marquages réalisés sur ces cellules sont : anti-CD3 humain marqué PE-Cy5, anti-CD11c humain marqué PE, anti-CD14PE humain, anti-CD20 humain FITC, anti-CD40 humain FITC, anti-CD80 humain FITC, anti-CD83 humain FITC, anti-CD86 humain FITC et anti-HLADR humain FITC (BD Biosciences, Etats Unis) (paragraphe 5 Cytométrie en flux, Matériels et Méthodes).
59 2) La fraction monocytes maturée en cellules dendritiques est activée avec l’antigène TBA-Nter : peptide N-terminal de la TBA à 10 µ g/ml. Le jour de la stimulation, le peptide TBA-Nter, 1 mg lyophilisé, est resuspendu dans un 1 ml de milieu de culture, puis 10 µl de la solution (soit 10µg) sont ajoutés dans les puits.
3) Des cytokines et des séquences immunostimulatrices sont ajoutées sur la fraction monocytes-/NK-. De IL-2 à 10 ng/ml (10 µl d’une solution mère à 1 µg/ml sont ajoutés dans les puits de volume final 1 ml), de IL-4 à 10 ng/ml (10 µl d’une solution mère à 1 µg/ml sont ajoutés dans les puits de volume final 1 ml) (Miltenyi Biotec Bergisch Gladbach, Allemagne) et des CpG à 2,5 µ g/mL (10 µl d’une solution mère à 250 µ g/ml sont ajoutés dans les puits de volume final 1 ml) (CpG ODN 2006 5’- TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT– 3’, Eurogentec, Liège, Belgium).
A J7 : Le lendemain de la stimulation, les cellules sont mises en coculture et sont mélangées selon le ratio cellule dendritique/PBMCs monocytes-/NK- 1/4.
Les cellules dendritiques étant adhérentes, la fraction PBMCs monocytes-/NK- est homogénéisée et est ajoutée dans les puits contenant les cellules dendritiques.
A J10 : Trois jours après la coculture, les cellules mélangées sont restimulées avec l’antigène TBA-Nter à 10 µg/ml (10 µl d’une solution mère à 1 mg/ml sont ajoutés dans les puits (soit 10 µg/ml)) et IL-2 à 10 ng/ml (10 µl d’une solution mère à 1 µg/ml sont ajoutés dans les puits de volume final 1 ml), IL-4 à 10 ng/ml (10 µl d’une solution mère à 1 µg/ml sont ajoutés dans les puits de volume final 1 ml) (Miltenyi Biotec Bergisch Gladbach, Allemagne) et CpG à 2,5 µg/mL (10 µl d’une solution mère à 250 µg/ml sont ajoutés dans les puits de volume final 1 ml) (CpG ODN 2006 5’- TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT– 3’, Eurogentec, Liège, Belgium).
A J14 : Les surnageants de culture sont prélevés pour doser la présence d’anticorps IgM et/ou IgG anti-TBA-Nter selon un ELISA décrit ultérieurement (paragraphe 8.2.2 Matériels et Méthodes). Un ml de milieu de culture est ajouté dans les puits, maintenus à 37°C, sous atmosphère humide à 5% de CO2.
60 A J21 : Les surnageants de cultures sont prélevés et de nouveau dosés pour la présence d’anticorps IgM et/ou IgG anti-TBA-Nter par ELISA (paragraphe 8.2 Les dosages immunologiques utilisant la BoNT/A, Matériels et Méthodes). Les puits sont repris avec 1 ml de milieu de culture et maintenus à 37°C, sous atmosphère humide à 5% de CO2.
Figure 15. Principe de l’immunisation in vitro par coculture de cellules.
1
5.1.2 Utilisation de PBMCs après élimination des cellules « Natural Killer »
Ce type d’immunisation se déroule sur une période plus courte que le protocole par coculture. En effet, l’ensemble des opérations est effectuée dans un même puits. Le principe est de maturer les monocytes présents dans la fraction dépourvue en NK des PBMCs et d’initier une réponse immunitaire en ajoutant l’antigène : TBA-Nter, des cytokines et séquences immunomodulatrices CpG.
5.1.2.1 Description du protocole
1 A J0 : Les PBMCs purifiés selon le protocole précédent (paragraphe 3 Matériels et Méthodes) et déplétées en NK (paragraphe 4 Matériels et Méthodes) sont mises eu culture sur plaque 96 puits à raison de 2x106 cellules/puits. Les monocytes présents sont maturés par l’ajout de GM-CSF 25 ng/ml (10 µl d’une solution mère à 2,5 µg/ml sont ajoutés
61 dans les puits de volume final 1 ml) et de l’IL-4 50 ng/ml (10 µl d’une solution mère à 5 µg/ml sont ajoutés dans les puits de volume final 1 ml) en présence de IL-2 à 10 ng/ml (10 µl d’une solution mère à 1 µg/ml sont ajoutés dans les puits de volume final 1 ml), de IL-4 à 10 ng/ml (10 µl d’une solution mère à 1 µg/ml sont ajoutés dans les puits de volume final 1 ml) (Miltenyi Biotec Bergisch Gladbach, Allemagne) et de CpG à 2,5 µg/mL (10 µl d’une solution mère à 250 µ g/ml sont ajoutés dans les puits de volume final 1 ml) (CpG ODN 2006 5’- TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT– 3’, Eurogentec, Liège, Belgium). L’ajout de 10 µg/ml de l’antigène TBA-Nter (1 mg est resuspendu dans un 1 ml de milieu de culture puis 10 µl de la solution est ajouté dans les puits pour faire 10 µg) a pour but de stimuler une réponse immunitaire spécifique de ce peptide. Les cellules sont gardées 7 jours à 37°C, sous atmosphère humide à 5% de CO2. A J0, les différents marquages réalisés précedemment sont réalisés (anti-CD3 humain marqué PE-Cy5, anti-CD11c humain marqué PE, anti-CD14PE humain, anti-CD20 humain FITC, anti-CD40 humain FITC, anti-CD80 humain FITC, anti- CD83 humain FITC, anti-CD86 humain FITC et anti-HLADR humain FITC (BD Biosciences, Etats Unis) (paragraphe 5 Cytométrie en flux, Matériels et Méthodes)).
A J3 : Trois jours après la première stimulation, les cellules sont restimulées avec l’antigène TBA-Nter à 10 µg/ml (10 µl d’une solution mère à 1 mg/ml sont ajoutés dans les puits (soit 10 µg/ml)) et de IL-2 à 10 ng/ml (10 µl d’une solution mère à 1 µg/ml sont ajoutés dans les puits de volume final 1 ml), de IL-4 à 10 ng/ml (10 µl d’une solution mère à 1 µ g/ml sont ajoutés dans les puits de volume final 1 ml) (Miltenyi Biotec Bergisch Gladbach, Allemagne) et des CpG à 2,5 µ g/mL (10 µl d’une solution mère à 250 µ g/ml sont ajoutés dans les puits de volume final 1 ml) (CpG ODN 2006 5’- TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT– 3’, Eurogentec, Liège, Belgium).
A J7 : Quatre jours après la seconde stimulation, les surnageants de cultures sont prélevés pour doser la présence d’anticorps IgM et IgG anti-TBA-Nter selon l’ELISA décrit plus loin (paragraphe 8.2 Les dosages immunologiques utilisant la BoNT/A, Matériels et Méthodes). Un ml de milieu de culture est ajouté dans les puits et maintenus à 37°C, sous atmosphère humide à 5% de CO2. A J7, les différents marquages réalisés précedemment sont réalisés (anti-CD3 humain marqué PE-Cy5, anti-CD11c humain marqué PE, anti-CD14PE humain, anti-CD20 humain FITC, anti-CD40 humain FITC, anti-CD80 humain FITC, anti-
62 CD83 humain FITC, anti-CD86 humain FITC et anti-HLADR humain FITC (BD Biosciences, Etats Unis) (paragraphe 5 Cytométrie en flux, Matériels et Méthodes)).
5.1.2.2 Cinétique de dosage
Afin d’étudier l’apparition des IgGs caractéristiques de la réponse secondaire, des boosts ou des re-stimulations par l’antigène TBA-Nter à 10 µ g/ml (10 µl d’une solution mère à 1 mg/ml sont ajoutés dans les puits (soit 10 µ g/ml)) et IL-2 à 10 ng/ml (10 µl d’une solution mère à 1 µg/ml sont ajoutés dans les puits de volume final 1 ml), IL-4 à 10 ng/ml (10 µl d’une solution mère à 1 µ g/ml sont ajoutés dans les puits de volume final 1 ml) (Miltenyi Biotec Bergisch Gladbach, Allemagne) et CpG à 2,5 µg/mL (10 µl d’une solution mère à 250 µ g/ml sont ajoutés dans les puits de volume final 1 ml) (CpG ODN 2006 5’- TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT– 3’, Eurogentec, Liège, Belgium) ont été effectués à J3 et J7.
Les surnageants de cultures ont été prélevés à J12 pour dosage d’anticorps IgM et IgG anti- TBA-Nter selon un ELISA décrit dans la suite (paragraphe 8.2 Les dosages immunologiques utilisant la BoNT/A, Matériels et Méthodes).
Figure 16. Principe de l’immunisation in vitro par activation des cellules dendritiques dans les PBMCs sans NK.
63