Pour procéder à l’immunisation in vitro par Tat101, différents types cellulaires ont été utilisés : PBMCs totaux, des PBMCs sans NK et des lymphocytes B purifiés (paragraphes 3, 4 Matériels et Méthodes). Différentes formes de Tat101 et différentes protéines de fusion réalisées avec Tat101 ont été testées comme immunogène. Tat est connu comme étant une molécule autoadjuvante chez la souris (Kittiworakarn et al., 2006). D’autre part, in vivo chez la souris, il a été décrit que l’injection d’une protéine de fusion associant Tat101 et le domaine ZZ de Staphyloccocus aureus qui permet d’augmenter l’immunogénicité des molécules (Léonetti et al., 1998), à des effets stimulants sur la production d’IgGs (Gadzinski et al., 2012; Léonetti et al., 2010). La protéine de fusion ZZTat101 a été testée dans notre système d’immunisation in vitro pour évaluer sa capacité à activer la réponse immunitaire sur des cellules humaines.
Nous avons déposé 1x106 cellules/puits dans une plaque de 24 puits en milieu de culture
Le protocole d’immunisation in vitro suivant a été utilisé :
- Une immunisation in vitro en présence de ZZTat101 et de chacun de ses dérivés ZZ et Tat101 ou un mélange ZZ + Tat101 sur des PBMCs, PBMCs NK- et des lymphocytes B purifiés.
Le même protocole a été utilisé pour diverses formes de ZZTat101 : ZZTat22-57C(22- 37)S et ZZTat22-57, ZZTat101Ø.
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5.2.1 Rôle des composants de ZZTat101 : immunisation in vitro par
ZZTat101, ZZ et Tat101 1
A J0 : Des PBMCs, des PBMCs NK- et des lymphocytes B purifiés ont été stimulés soit par 10 µ g de ZZTat101 (200 µ g de ZZTat101 lyophilisés sont resuspendus dans 1 ml de milieu de culture et 50 µl de cette solution sont déposés dans les puits), par ZZ (3,2 mg de ZZ lyophilisés sont resuspendus dans 1 ml d’eau MilliQ et 3,2 µl de cette solution sont déposés dans les puits), par Tat101 (100 µ g de Tat lyophilisés sont resuspendus dans 1 ml de milieu de culture,et 100 µl de cette solution sont déposés dans les puits) ou soit par une coculture ZZ +
64 Tat101 (5 µg correspondant à 1,6 µl de la solution précédente à 3,2 mg/ml de ZZ + 5 µ g correspondant à 50 µl de la solution précédente de Tat101 à 100 µg/ml).
A J3 : Les cellules sont restimulées par 5 µ g ou 10 µg de chacun des composants à partir des solutions utilisées à J0.
A J7 : Les surnageants de cultures sont prélevés pour doser la présence d’anticorps IgM et IgG anti-Tat selon un ELISA décrit dans le paragraphe 8.4, Les dosages immunologiques des anticorps anti-Tat, Matériels et Méthodes. Les puits sont complétés avec 1 ml de milieu de culture et maintenus à 37°C, sous atmosphère humide à 5% de CO2.
5.2.2 Mécanisme d’action de ZZTat101 : immunisation in vitro par
ZZTat101 et plusieurs formes mutantes 1
A J0 : Des PBMCs, des PBMCs NK- et des lymphocytes B purifiés ont été stimulés par soit 10 µg de ZZTat101 (125 µg de Tat lyophilisés sont resuspendus dans 1 ml de milieu de culture et 80 µl de cette solution sont déposés dans les puits), 10 µg de ZZTat22-57C(22-37)S
(100 µg de lyophilisés sont resuspendus dans 1 ml de milieu de culture, et 100 µl de cette solution sont déposés dans les puits), 10 µg de ZZTat22-57 (100 µg de ZZTat22-57 lyophilisés sont resuspendus dans 1 ml de milieu de culture et 100 µl de cette solution sont déposés dans les puits) ou soit 10 µg de ZZTat101Ø (100 µ g de ZZTat101Ø lyophilisés sont resuspendus dans 1 ml de milieu de culture et 100 µl de cette solution sont déposés dans les puits).
A J3 : Les cellules sont restimulées par 10 µ g de chacun des composants à partir des solutions utilisées à J0.
A J7 : Les surnageants de cultures sont prélevés pour doser la présence d’anticorps IgM et IgG anti-Tat selon un ELISA décrit dans la suite (paragraphe 8.4, Les dosages immunologiques des anticorps anti-Tat, Matériels et Méthodes). Les puits sont complétés par 1 ml de milieu de culture et maintenus à 37°C, sous atmosphère humide à 5% de CO2.
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5.3
Cytométrie en flux5.3.1 Tampon utilisé
L’ensemble des réactifs, cellules et anticorps sont dilués en PBS (PBS: Phosphate Buffer Saline: 10 mM de phosphate de potassium pH 7.4 et 150 mM de chlorure de sodium) supplémenté avec 1 % d’albumine sérique bovine (BSA).
5.3.2 Principe
La cytométrie en flux est une technique qui permet d’étudier simultanément différentes caractéristiques physiques et biologiques de cellules isolées dans un flux liquide. Les cellules, alignées les unes derrière les autres, défilent à grande vitesse devant un faisceau laser. Chaque cellule va diffracter la lumière soit dans l’axe du laser (le capteur correspondant est le FSC forward scatter) soit à 90° de l’incidence du laser (le capteur est le SSC side scatter). Ces deux signaux nous donnent respectivement des informations sur la taille et la structure (granulosité) de chacune des cellules. Le laser permet également d’exciter des fluorophores présents sur la cellule tels que FITC ou PE excitables à la même longueur d’onde mais qui émettent à des longueurs d’ondes différentes. Les signaux mesurés, sont visualisés, après traitement informatique, sous forme de graphiques bidimensionnels (nuages de points). Pour ces études le cytomètre trois couleurs Guava (Millipore, Billerica, Massachussets, United States) a été utilisé.
5.3.3 Marquage
Les marquages sont réalisés à J0 (le jour de la purification des cellules) pour évaluer la pureté des cellules obtenus après purification, sélection ou élimination et à J7 (7 jours après immunisation in vitro) pour évaluer la différenciation des cellules reflétant l’activation de la réponse immunitaire. Les anticorps utilisés sont des marqueurs membranaires spécifiques de chaque type de cellules utilisés lors de l’immunisation in vitro.
Sur une plaque 96 puits, 100 000 cellules/puits sont marquées avec différents anticorps couplés à un fluorophore (BD Biosciences, Etats-Unis) pendant 35 min à 4°C à l’obscurité. L’ensemble des anticorps marqués utilisés sont présentés dans le tableau ci-après (Tableau 2). Après centrifugation à 1500 rpm pendant 10 minutes à 4°C, le milieu contenant les anticorps marqués est éliminé et les cellules sont lavées avec 100 µl de PBS supplémenté avec 1 %
66 d’albumine sérique bovine (BSA). Les cellules sont fixées à température ambiante à l’obscurité avec 4% paraformaldéhyde (4% PFA) pendant 15 minutes. Après centrifugation à 1500 rpm à 4°C, le milieu contenant le paraformaldéhyde est éliminé et les cellules sont lavées avec 130 µl de PBS supplémenté avec 1 % d’albumine sérique bovine (BSA).
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Anticorps marqués Rôle Dilution/Volume/Concentration Fournisseur
Souris anti-CD3 humain-PE- Cy5 (monoclonal)
Marqueur Lymphocytes T
20 µl pur BD Biosciences
Souris anti- CD11c humain – PE (monoclonal)
Marqueur cellules dendritiques
20 µl pur BD Biosciences
Souris anti-CD40 humain- FITC (monoclonal) Marqueur cellules dendritiques et activation réponse immunitaire 20 µl 1/4 BD Biosciences
Souris anti-CD80 humain- FITC (monoclonal) Marqueur cellules dendritiques, lymphocytes B et activation réponse immunitaire 20 µl 1/5 BD Biosciences
Souris anti-CD83 humain- FITC (monoclonal) Marqueur cellules dendritiques et activation réponse immunitaire 20 µl pur BD Biosciences
Souris anti-CD86 humain- FITC (monoclonal) Marqueur cellules dendritiques, lymphocytes B et activation réponse immunitaire 20 µl 1/5 BD Biosciences
Souris anti-HLADR humain- FITC (monoclonal) Marqueur lymphocytes B et activation réponse immunitaire 20 µl 1/125 BD Biosciences
Souris anti-CD20 humain- FITC (monoclonal)
Marqueur lymphocytes B
20 µl pur BD Biosciences
Souris anti-CD19 humain-PE (monoclonal)
Marqueur lymphocytes B
10 µl 1/25 Miltenyi Biotec
Souris anti-CD56 humain-PE (monoclonal)
Marqueur Natural Killer
20 µl 1/125 BD Biosciences
Souris anti-CD14 humain- FITC (monoclonal)
Marqueur Monocytes
20 µl pur BD Biosciences
Tableau 2. Récapitulatif de l’ensemble des anticorps marqués utilisés pour les expériences de cytométrie en flux.
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