1 Les cellules du puits présentant le meilleur signal lors du test pour la détection des IgMs anti TBA-Nter ont été immortalisées avec le virus EBV suivant le protocole précédement décrit. Après un mois de culture, 7 des 30 puits réalisés présentent des IgMs anti-TBA-Nter dans leurs surnageants.
Les autres puits de l’immunisation in vitro ont été fusionnés avec l’hétéromyélome HM mais aucun hybridome n’a été obtenu. Sur les 7 puits contenant des lymphocytes B immortalisés sécréteurs d’IgMs anti-TBA-Nter, nous avons voulu étudier l’effet de l’acridine orange sur la commutation1isotypique. En effet récemment, des publications ont décrit l’effet de l’acridine orange, agent intercalant de l’ADN sur la commutation des IgMs en IgGs (Paizi et al., 1995; Spira et al., 1996). Nous avons testé cet agent à différentes concentrations et après plusieurs clonages en dilution limite, malheureusement sans réussir à obtenir des IgGs anti-TBA-Nter. D’autres stratégies, comportant notamment l’utilisation de cytokines ou des UV qui induiraient la commutation isotypique pourraient être évaluées (Aversa et al., 1994; Avery et al., 2008; Coffman et al., 1993; Pène et al., 2004; Rosén and Klein, 1983).
155
CONCLUSIONS ET
PERSPECTIVES
156 L’objectif de cette étude était d’établir un protocole permettant l’obtention d’anticorps monoclonaux humains spécifiques d’une cible d’intérêt à partir de lymphocytes B naïfs. Pour atteindre cet objectif, il était nécessaire de mettre au point une immunisation in vitro afin de stimuler la différenciation de ces lymphocytes B en plasmocytes sécréteurs d’anticorps dirigés contre notre cible. De plus pour cloner ces plasmocytes et assurer une production illimitée en anticorps, une étape d’immortalisation est indispensable. Nous avons choisi comme cible modèle un peptide de la toxine botulique A. Ce choix a été basé sur deux critères :
1) l’obtention d’anticorps monoclonaux humains dirigés contre la toxine botulique et potentiellement neutralisant est d’un intérêt thérapeutique évident;
2) rares étant les personnes susceptibles d’avoir été en présence de toxine botulique A, il devait donc être plus aisé d’obtenir du sang de donneurs naïfs vis-à-vis de ce peptide.
Dans un premier temps, le dosage sous un format immunoenzymatique spécifique du peptide N-terminal de la toxine botulique A, nous a permis de mettre en évidence l’absence d’IgMs et d’IgGs anti-TBA-Nter dans le plasma des donneurs de sang utilisé.
Puis nous avons testé deux protocoles d’immunisation in vitro:
1) élimination des Natural Killer (NK) et activation par des cytokines et l’antigène 2) activation séparée des monocytes et des lymphocytes suivie d’une coculture.
Nos résultats montrent que ces deux protocoles permettent de déclencher une réponse anticorps primaire qui se traduit par la production d’IgMs spécifiques de la cible. Cependant le premier protocole donne de meilleurs résultats au niveau de la réponse en IgMs spécifiques. L’augmentation du nombre de stimulation avec les cytokines et l’antigène au cours de ce protocole a permis d’améliorer légèrement cette réponse en IgMs, mais pas de déclencher une réponse en IgGs spécifiques.
D’autre part aucune méthode d’immortalisation (à l’aide de l’EBV ou d’un myélome) n’a permis d’obtenir des clones stables des lymphocytes B producteurs d’anticorps anti-TBA- Nter. Nous avons précédemment montré que la fusion entre les lymphocytes B humains et l’hétéromyélome HM était réalisable. Les problèmes que nous rencontrons sont dûs soit à des modifications induites par l’immortalisation avec l’EBV qui empêche l’obtention d’hybridomes stables, soit au faible pourcentage de lymphocytes B humains producteurs d’anticorps spécifiques de notre cible qui rend très aléatoire un fusion après immunisation in
vitro.
Pour pallier ces problèmes, nous pourrions envisager de réaliser un enrichissement des lymphocytes B stimulés qui se différencient en plasmocytes. En effet comme lors de leur différenciation les lymphocytes B perdent leurs immunoglobulines membranaires, nous
157 pourrions éliminer les lymphocytes B non stimulés à l’aide de billes magnétiques fonctionnalisées par le greffage d’un anticorps anti-Immunoglobuline humaines. Un enrichissement des lymphocytes B basé sur ce principe a déjà été décrit par Kozbor et Roder 1981 (Kozbor and Roder, 1981). Dans cette expérience une seule stimulation serait effectuée car nous avons montré que l’incrémentation du nombre de stimulations conduit à l’augmentation de la stimulation non spécifique des lymphocytes B. L’augmentation du pourcentage en lymphocytes B différenciés par la stimulation devrait nous permettre d’accroitre nos chances d’obtenir des hybridomes producteurs d’anticorps dirigés contre notre cible.
1
Une première expérience a été réalisée afin de commuter les plasmocytes producteurs d’IgMs spécifiques en plasmocytes producteurs IgGs spécifiques mais sans succès. Cependant d’autres pistes basées sur l’utilisation des UV et/ou de cytokines particulières (IL-21) ou molécules de costimulation (CD40) restent à exploiter.
158
DEUXIEME MODELE
D’ETUDE
La protéine transactivatrice Tat
du virus de l’immunodéficience
159
160 Compte tenu des difficultés, cette étude a été recentré sur une nouvelle cible pour réaliser nos expériences d’immunisations in vitro. Nous avons utilisé comme modèle, la protéine transactivatrice Tat du virus de l’immunodéficience humaine type 1 (VIH-1). Dans une première partie, la protéine Tat101, ses caractéristiques et propriétés, ainsi que les raisons qui nous ont conduit à utiliser la protéine Tat101 dans notre système d’immunisation in vitro seront présentés. Dans une seconde partie, les résultats obtenus avec la protéine de fusion ZZTat101 et ses dérivés dans le système d’immunisation in vitro précédemment mis en place seront présentés. L’ensemble de ces résultats fait l’objet d’un article soumis pour publication. 1
1
La protéine transactivatrice Tat101 du virus de
l’immunodéficience humaine type 1 (VIH-1)
1.1
Rôle de Tat101 dans l’infection au VIH-1
6 Tat est le transactivateur transcriptionnel du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Tat est une protéine d’une masse moléculaire d’environ 11,5 kDa constituée de 86 à 101 acides aminés. Tat permet de réguler la transcription des gènes viraux durant les étapes précoces du cycle viral et joue donc un rôle essentiel dans la multiplication et la réplication du virus VIH-1 (Dayton et al., 1986). Tat est synthétisé lors de l’infection par le VIH-1 de ses cellules cibles, les lymphocytes T CD4+. Tat apparait précocement lors de l’infection puisque c’est une des premières molécules exprimées par le virus et son génome viral (un génome ARN). Tat permet de diriger les éléments de la machinerie de transcription de la cellule infectée vers l’ARN viral en cours de synthèse. Elle permet donc d’activer la transcription du génome viral. C’est pour cela qu’elle est appelée transactivateur transcriptionnel. L’expression de Tat a pour résultat la production d’ARN viraux fonctionnels entiers et polyadénylés dans la cellule infectée. Par ailleurs, Tat exerce de nombreux effets lors de l’infection par le VIH-1. Par exemple, Tat semble impliqué dans la régulation de la transcription inverse qui précède l’intégration du génome viral dans le génome cellulaire grâce à la transcriptase inverse. Tat jouerait également un rôle dans le remodelage de la chromatine et dans le « capping » des ARNm viraux. Lors de l’infection par le VIH-1, Tat interfère avec 775 protéines différentes de manière directe (dérégulation faisant intervenir une interaction physique) ou de manière indirecte (dérégulations via l’activation de voies de signalisation) (Fu et al., 2009; Ptak et al., 2008)111
161 1