13x107 cellules 1C2 sont fusionnées avec 2,6x107 cellules d’hétéromyélome HM. 15x107 cellules de 2C10 sont fusionnés avec 3x107 cellules d’hétéromyélome HM. 14x107 cellules de 1E3 sont fusionnées avec 2,8x107 cellules d’hétéromyélome HM. Les produits de fusion sont resuspendus dans un milieu de culture contenant de l’HAT 50X et de l’ouabaïne à la concentration de 5x10-6 M puis déposés sur 5 plaques 96 puits contenant des cellules nourricières. Ces cellules nourricières (cellules mononuclées du sang (PBMCs) irradiées), produisent des facteurs de croissance favorisant la survie et la croissance des hybridomes. Après 7 jours et un changement de milieu, les plaques de fusions sont lues pour détecter la présence d’hybridomes.
Figure 33. Hybridomes issus de la fusion des lymphocytes B immortalisés avec l’hétéromyélome HM. Image prise 7 jours après fusion. Microscope optique x40.
112 Pour les trois fusions, 100% des puits de fusion présentent des hybridomes.
Comme attendu aucun des anticorps anti-SEB n’a été détecté, par le test immunoenzymatique, dans les surnageants de la fusion des cellules issus du puits 1E3. De même l’ensemble des puits de la fusion des cellules de 2C10 se sont révélés négatifs pour la présence d’anticorps anti-SEB. Par contre, nous avons pu identifier un puits de la fusion des cellules issues de 1C2 qui contenait un hybridome et pour lequel on obtenait un signal positif avec le test immunoenzymatique. Afin d’isoler et de stabiliser cet hybridome nous avons réalisé un clonage par dilution. Malheureusement au cours de ce clonage cet hybridome a perdu sa capacité de production d’IgGs anti-SEB.
113
CONCLUSIONS ET
PERSPECTIVES
114 Du fait de l’absence de traitement contre l’entérotoxine B de Staphyloccocus aureus (SEB), et de la possibilité de s’en servir à des fins malveillantes, le développement d’outils thérapeutiques efficaces semble pertinent. Dans ce contexte, il est intéressant d’évaluer l’effet de l’immunothérapie, nous avons cherché à produire des anticorps dirigés contre la SEB.
Dans un premier temps, le dosage sous un format immunoenzymatique spécifique de la SEB nous a permis de détecter la présence d’IgGs anti-SEB dans les plasma des donneurs de sang utilisé. La présence d’IgGs spécifiquement dirigés contre la SEB est le reflet de la présence de lymphocytes B sécréteurs d’anticorps dirigés contre la SEB. Nous avons mis au point un protocole d’immortalisation efficace des lymphocytes B mémoires utilisant le virus Epstein-Barr (EBV). Nous avons ainsi réussi à obtenir 6 puits de lymphocytes B immortalisés par le virus Epstein-Barr et sécréteurs d’anticorps IgGs anti-SEB. Par contre, nous avons été confrontés à un problème de stabilité des lymphocytes B immortalisés et à une perte de la capacité de sécrétion en anticorps anti-SEB. Pour pallier ces problèmes, nous avons exploré différentes pistes. La première a consisté à cloner par dilution limite les lymphocytes B afin d’isoler la cellule sécrétrice d’anticorps et la stabiliser. Ces lymphocytes B immortalisés étant des grosses grappes, isoler une cellule s’est révélé compliqué voire impossible. Une seconde piste étudiée a été de coupler l’étape d’immortalisation virale à une immortalisation cellulaire avec un myélome.
Nous avons exploré différents protocoles d’immortalisation cellulaire impliquant des myélomes murins et un hétéromyélome humain/murin et les lymphocytes B immortalisés. Malheureusement, malgré diverses conditions de fusion aucun hybridome ne fut obtenu. Afin de mettre au point un protocole permettant la fusion de lymphocytes B humains, nous avons comparé différentes conditions de fusion avec l’hétéromyélome HM qui nous paraissait être le partenaire de fusion le plus adéquat. Pour cette étude, nous avons utilisé des lymphocytes B humains purifiés à partir de sang de donneurs. Cette étude nous a permis d’obtenir des hybridomes et donc de sélectionner les conditions les plus favorables pour la fusion. En utilisant ces conditions, nous avons réussi à obtenir un hybridome sécréteur d’anticorps anti- SEB à partir de lymphocytes B préalablement immortalisés. Au cours des étapes de clonages nécessaire pour l’isolation et la stabilisation du clone, l’hybridome a malheureusement perdu sa capacité de production d’anticorps anti-SEB.
Malgré les limitations et les difficultés rencontrées avec cette technique, les anticorps humains issus de donneurs infectés ou vaccinés présentent un attrait en recherche et devraient être développés, ce qui demanderait notamment d’améliorer la stabilité et le rendement des
115 étapes d’immortalisation virale (partenaire virale EBV) et cellulaire (fusion avec un partenaire myélomateux). On pourrait également envisager d’obtenir l’ADN codant pour les anticorps humains par PCR à partir des grappes de cellules obtenues après immortalisation et qui produisent un anticorps d’intérêt. Par la suite cet anticorps pourrait être produit dans des cellules de mammifères après transfection par un plasmide contenant cet ADN.
116 1
2
ème
Partie :
PRODUCTION D’ANTICORPS
MONOCLONAUX HUMAINS
A PARTIR DE
LYMPHOCYTES B HUMAINS
DE DONNEURS NAIFS
PAR IMMUNISATION IN
VITRO
117 1 Dans la deuxième partie de ma thèse, nous nous sommes intéressés à la production d’anticorps monoclonaux humains à l’aide de lymphocytes B naïfs, extraits de sang périphérique, grâce à l’immunisation in vitro. L’immunisation in vitro consiste à stimuler in
vitro par l’ajout d’un antigène-cible des lymphocytes B pour induire la production d’anticorps
dirigés contre l’antigène. Cette stratégie pourrait permettre la production d’anticorps monoclonaux humains contre des antigènes pour lesquels il n’existe pas de donneurs infectés ou vaccinés. Mettre en place des protocoles d’immunisation in vitro nécessite une bonne connaissance sur le fonctionnement du système immunitaire, des lymphocytes B et de la réponse anticorps in vivo. Dans un premier temps, la réponse anticorps in vivo et la stimulation des lymphocytes B suite à la pénétration d’un agent étranger dans l’organisme seront présentés. Dans un second temps, seront présentés les résultats obtenus par immunisation in vitro avec deux molécules modèles, le peptide N-terminal de la toxine botulique A (TBA-Nter) et la protéine transactivatrice Tat101 du virus de l’immunodéficience de type 1 (VIH-1).
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La réponse anticorps in vivo
1 In vivo, la production d’anticorps spécifiques d’un antigène engage des lymphocytes
B, des lymphocytes T, des cellules présentatrices d’antigène (CPA), des cytokines et des molécules de costimulation. Deux types de réponses anticorps existent selon la nature de l’antigène: la réponse T-dépendante et la réponse T-indépendante.
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