3.5 Dispositif expérimental
3.5.2 Images d’échantillons biologiques épais
Outre une résolution spatiale élevée, il est nécessaire de garantir une sensibilité de détection convenable afin de réaliser des images en profondeur dans des tissus biologiques diffusants. De la
3.5. Dispositif expérimental
la lumière incidente. On l’évalue alors à -71dB en accumulant 50 images qui est la configuration retenue dans la suite. On souhaite ainsi privilégier ici la qualité des images plutôt que la vitesse d’exécution, qui est moins primordiale pour l’imagerie d’échantillons ex vivo. Une nouvelle fois, le bruit de détection étant assez élevé, la sensibilité reste plus faible que pour certains montages d’OCT plein champ.
Grâce à la modulation sinusoïdale appliquée à la surface de référence par la platine piézo-électrique, et à l’algorithme de combinaison des images performant (voir la sous-section 2.2.4), la fréquence d’acquisition d’une image en-face accumulée 50 fois est proche de 1Hz, comme c’est le cas pour la plupart des montages d’OCT plein champ [Sac08, Dub04, Saf12]
Cette vitesse peut être accrue en ouvrant davantage le diaphragme d’ouverture, ce qui aug-mentera le flux lumineuse incident sur l’échantillon. Le cas échéant, il faudra cependant s’assurer d’un parallélisme convenable de la surface de référence et de l’échantillon afin de conserver un bon contraste et donc une bonne sensibilité de détection. La planéité de l’échantillon est par ailleurs indispensable compte tenu de la profondeur de champ réduite des objectifs de micro-scope, qui est proche de 1,5µm pour ouverture numérique de 1,2. En effet si le basculement de l’échantillon correspond à une distance supérieure à l’étendue de la profondeur de champ, en plus d’une perte de résolution, la fenêtre de focalisation ne couvrira pas la totalité du champ observé sur une image en-face, et l’intensité du signal OCT ne sera donc pas uniforme.
On réalise une image en trois dimensions in situ d’un échantillon de peau d’une grenouille Xenopus Laevis(partie ventrale de l’animal) (voir Fig. 3.22 ci-après). On positionne l’échantillon sous une lamelle de verre (identique à celle du bras de référence) afin d’une part, de réduire les aberrations optiques, mais également d’aplanir l’échantillon, optimisant ainsi le signal mesuré. Le champ d’observation des images en-face est 75µm × 60µm.
Les coupes transverses présentées en figure 3.22a mettent en évidence les différences struc-tures composant l’échantillon de grenouille jusqu’à 100µm de profondeur. On note ainsi la pré-sence de deux couches proches de la surface puis de structures cellulaires contenant des noyaux qui deviennent de plus en plus denses en profondeur, où il est plus difficile de les distinguer. Enfin, à ∼ 60µm de profondeur, une nouvelle organisation du tissu apparaît, correspondant à une autre couche de l’échantillon.
Les images en-face (voir Fig. 3.22b) confirment les observations concernant l’accroissement de la densité cellulaire en profondeur et permettent d’évaluer la dimension des cellules et de leurs composites. De diamètre ∼ 40µm en surface (Fig. 3.22b(1)), ces cellules sont réduites à ∼ 10µm (Fig. 3.22b(3)) en profondeur.
(a) Les barres d’échelles correspondent à 10µm dans les deux directions.
(b) Les barres d’échelles correspondent à 10µm dans les deux directions.
Figure 3.22 – Coupes transverses d’images 3D d’un échantillon de grenouille Xenopus Laevis (a) et images en-face (b) à une profondeur de 10µm (1), 18µm (2), 20µm (3) et 30µm (4) dans l’échantillon.
3.5. Dispositif expérimental
Ce type d’organisation cellulaire est également observable pour un échantillon de peau hu-maine, comme le montrent les différentes images de la figure 3.23.
(a) Les barres d’échelles correspondent à 10µm dans les deux directions.
(b) Les barres d’échelles correspondent à 10µm dans les deux directions.
Figure 3.23 – (a) : coupes transverses d’une image 3D d’un échantillon de peau humaine ex situ. (b) : images en-face (b) à une profondeur de 10µm (1), 20µm (2), 30µm (3) et 41µm (4) dans l’échantillon.
Les noyaux des cellules, entourés d’un cytoplasme rétrodiffusant un fort signal, apparaissent sombres sur les images [Raj95, Tsa14]. On est alors capable d’observer de façon détaillée dif-férentes couches successives de la peau, dont la plus superficielle est le stratus corneum et ne contenant pas de noyau, qui est sus-jacente à la couche épineuse supérieure, qui constitue la
première couche viable de la peau capable de se renouveler [Raj95], et à la couche épineuse inférieure. Une telle imagerie en trois dimensions de la peau pourrait permettre, par exemple, de détecter des carcinomes épidermodoïdes, ou spinocellulaires, se développant dans la couche épineuse de l’épiderme qui sont parmi les cancers de la peau les plus fréquents.
Afin d’ajuster précisément les deux fenêtres l’une par rapport à l’autre lors de l’acquisition de la pile d’images, il est primordial de connaître l’indice moyen de l’échantillon. On évalue alors la position optimale de la mise au point, i.e. de la fenêtre de focalisation, pour une différence de marche donnée, ce qui nous permet de déduire le rapport entre les déplacements des deux fenêtres à une certaine profondeur (voir Eq. (1.32)), et donc l’indice de réfraction moyen de la peau de grenouille.
De cette façon, on mesure un indice moyen de ∼ 1,33 correspondant ainsi à celui de l’eau. Concernant l’échantillon de peau humaine, on estime un indice moyen de 1,43, ce qui est en accord avec l’indice de réfraction de la couche épidermique de la peau, donné dans la littérature pour l’intervalle spectral considéré [Din06].
On note d’autre part, que l’utilisation d’un filtre optimisant la résolution axiale en profondeur permet de conserver une résolution importante dans les tissus et de distinguer des structures très proches les unes des autres, comme l’illustrent notamment les coupes transverses de l’image de peau de grenouille (Fig. 3.22a) dont différentes couches proches les une des autres (autour d’une profondeur de ∼ 10µm ainsi qu’aux alentours d’une profondeur de ∼ 50µm de profondeur) sont distinguables. Bien que la microscopie confocale soit sujette à une meilleure pénétration dans ce type de tissu [Raj95], elle ne permet cependant pas de représenter les images selon une coupe transverse avec une résolution axiale de qualité similaire à la résolution latérale. Cela entraîne donc une perte d’information qui n’est pas présente avec le système d’OCT présenté ici. On est par exemple capable de mesurer précisément la dimension longitudinale des cellules épineuses de la peau et ainsi d’identifier leur morphologie en trois dimensions, ce qui est plus difficile dans le cas de la microscopie confocale [Raj95].
Ce montage d’OCT plein champ à haute résolution offre donc la possibilité d’observer des détails et des structures présents dans les tissus biologiques ainsi que le permettrait la micro-scopie confocale, à la différence près que l’OCT plein champ ne requiert pas de balayage latéral et surtout, qu’il possède une réponse impulsionnelle axiale de meilleure qualité favorisant une représentation en coupe transverse (i.e. selon le plan XZ) qui apporte d’autres informations comme on a pu le montrer avec l’échantillon de peau.