Figure 1.31 – Images d’un muscle de queue de crevette utilisant un système d’OCT plein champ sensible au contraste de polarisation. (a),(b) : images d’intensité en-face à 30µm et 100µm de profondeur, respectivement. (c),(d) : images correspondantes en contraste de polarisation. Les couples (a),(c) et (b),(d) illustrent les deux différents types de contrastes. Issues de [Mon07].
1.6 Conclusion
La mise au point d’un système d’imagerie optique, non invasif et capable de réaliser des images tridimensionnelles d’échantillons biologiques, est confrontée à l’extinction du signal ré-trodiffusé à mesure que l’on pénètre en profondeur, celle-ci étant généralement dominée par la diffusion de la lumière dans les tissus. Ce phénomène, en plus de réduire l’intensité du signal, génère un fond lumineux provenant de l’ensemble des photons multidiffusés dans l’échantillon et qui dégrade fortement le rapport signal sur bruit.
Afin de s’affranchir de ce signal parasite, un dispositif de sectionnement axial est souvent utilisé, qu’il soit géométrique (microscopie confocale), basé sur la cohérence temporelle de la lumière (OCT) ou sur les propriétés non linéaires du champ électromagnétique (microscopies SHG et THG) ou bien reposant sur le couplage entre les ondes optiques et acoustiques (imagerie acousto-optique et photo-acoustique). Une longueur d’onde de la lumière adaptée combinée à un système de détection efficace garantira une sensibilité de détection importante et donc une profondeur de pénétration accrue. La plupart de ces techniques, n’utilisant pas de marquage spécifique et donc particulièrement bien adaptées à l’imagerie d’échantillons in vivo, lorsque leur vitesse d’exécution le permet, proposent le plus souvent une description structurelle de l’échan-tillon dont la morphologie et l’organisation des différents composants sont mis à jour. Chacun de ces systèmes étant caractérisé par des performances de résolution spatiale et de profondeur de pénétration dépendant de principes différents, ces performances sont assez disparates puisque la résolution spatiale peut atteindre des valeurs de l’ordre de la longueur d’onde (microscopie confocale, microscopie non linéaire) ou seulement de plusieurs dizaines de micromètres (ima-gerie acousto-optique et photo-acoustique) alors que la profondeur de pénétration est comprise
entre quelques centaines de micromètres (microscopie confocale, non linéaire et OCT) et plu-sieurs centaines de millimètres (imagerie acousto-optique et photo-acoustique). On résume les performances de ces principales techniques de microscopie 3D non invasive avec le diagramme suivant :
Figure 1.32 – Diagramme schématisant les performances de quelques techniques de microscopie optique non invasives adaptées à l’imagerie en profondeur : la microscopie confocale, la micro-scopie non linéaire par génération de second harmonique (SHG) et de troisième harmonique (THG), la tomographie photo-acoustique (PAT), l’OCT et l’OCT plein champ (FF-OCT).
Ce diagramme met donc en évidence le caractère intermédiaire de l’OCT, qui propose des performances entre la microscopie conventionnelle et l’imagerie basée sur l’utilisation d’ultrasons comme l’échographie traditionnelle par exemple. Ces capacités de vitesse et de pénétration en fond aujourd’hui un outil très répandu pour l’imagerie tomographique des tissus vivants.
Bien que ces performances en termes de pénétration soit légèrement en deçà de celles de l’OCT fréquentiel, l’OCT plein champ se distingue par sa résolution spatiale très importante, presque similaire à la microscopie confocale et non linéaire. Sa méthode d’acquisition d’images en-face lui confère également un potentiel de vitesse important qu’il reste encore à exploiter pleinement. Ainsi qu’on l’a montré dans les figures 1.23, 1.28, 1.29a et 1.29b, l’OCT plein champ permet de produire une information morphologique adaptée aussi bien à l’embryologie, l’oph-talmologie, la cancérologie. Cela constitue donc un champ d’applications vaste et pertinent qui justifie le développement de systèmes d’OCT plein champ afin de satisfaire au mieux les besoins des professionnels de santé et des biologistes.
Chapitre 2
L’OCT plein champ multispectral
“Attraper un chat noir dans l’obscurité de la nuit est la chose la plus difficile qui soit, surtout s’il n’y a pas de chat.” attribuée à Confucius Sommaire 2.1 Introduction . . . . 50 2.2 Montage expérimental . . . . 51 2.2.1 Source de lumière . . . 51 2.2.2 Détecteur . . . 52 2.2.3 Développement optique . . . 54 2.2.4 Optimisation de la vitesse d’acquisition par décalage de phase à
modu-lation sinusoïdale . . . 57 2.3 Compensation dynamique de la dispersion . . . . 59
2.3.1 Calcul de la différence de chemin optique induite par la rotation d’une lame compensatrice de dispersion . . . 60 2.3.2 Choix des propriétés propres aux lames compensatrices de dispersion . . 62 2.3.3 Mise en application de la correction des différences de dispersion . . . . 65 2.4 Performances . . . . 66 2.4.1 Résolution axiale . . . 66 2.4.2 Résolution latérale . . . 68 2.4.3 Sensibilité . . . 69 2.4.4 Ajustements pré et post-acquisition pour la superposition des images . . 71 2.5 Applications de l’imagerie multispectrale . . . . 73 2.5.1 Amélioration du contraste des images . . . 73 2.5.2 Différenciation d’échantillons . . . 75 2.6 Conclusion . . . . 77
L’étude spectroscopique d’un échantillon consiste généralement à illuminer celui-ci avec une source à spectre étendu, puis de détecter la lumière transmise ou réfléchie, en la décomposant selon la longueur d’onde. Certains éléments, tels que les molécules, possèdent une réponse spec-trale propre qui dépend des modes de vibrations générés par l’excitation électromagnétique de l’onde lumineuse. Ces derniers étant liés à la composition et à l’organisation spatiale de la molé-cule, en mesurant les propriétés spectrales de transmittance ou de réflectivité d’un échantillon, on extrait des informations physico-chimiques et structurelles.
Ce type de procédé est très répandu et utilisé dans des domaines divers comme la biophoto-nique, pour la caractérisation chimique d’échantillons biologiques [Xie02], l’imagerie hyperspec-trale environnementale ou océanographique [Dav02], ou encore l’optique atomique [Sri07].
2.1 Introduction
Le contraste des images en OCT plein champ conventionnel provient des différences d’in-dices de réfraction, i.e. des coefficients de réflexion, au sein de l’échantillon et fournit donc une information morphologique, ou structurelle. Comme on l’a vu, différentes expériences ont été menées afin de combiner l’OCT plein champ avec des techniques d’imagerie dans le but d’ajou-ter un nouveau type de contraste et de révéler certaines caractéristiques de l’échantillon : mise en évidence de l’ADN [Mak12], mesure des propriétés de biréfringence [Mon07].
L’association de l’OCT et de la spectroscopie peut également apparaître comme une mé-thode d’amélioration du contraste des images permettant de distinguer la présence de structures dans l’échantillon qui possède une réponse spectrale particulière [Mor00]. Plusieurs expériences d’OCT plein champ ont été réalisées afin d’étudier la réponse spectrale d’échantillons biologiques pour mettre en évidence les différences de pénétration de la lumière selon sa longueur d’onde [Sac08, Yu04], ou bien de détecter la présence de structures spécifiques au sein d’un échantillon [Dub08]. Bien qu’adapté aux mesures spectroscopiques, le calcul par transformée de Fourier du spectre du signal détecté, comme effectué dans [Dub08], est très contraignant en termes de vi-tesse d’exécution et de stabilité du montage. Un montage d’OCT plein champ à haute résolution spatiale, détectant simultanément deux bandes spectrales différentes, a également été développé [Sac08]. Cependant, la nécessité d’utiliser une caméra pour chaque bande considérée accroît le coût et l’encombrement du système, limitant dans le même temps la possibilité d’augmenter le nombre de bandes utilisées. Une expérience d’OCT plein champ dans trois bandes n’utilisant qu’une seule caméra a été réalisée en utilisant trois sources DEL différentes [Yu04]. Néanmoins le spectre global des trois sources ne s’étend que sur la partie visible du spectre et les performances atteintes dans chaque bande, en termes de résolution spatiale et de sensibilité, sont en deçà des valeurs usuelles de l’OCT plein champ.
On propose alors un système d’OCT plein champ, utilisant une lampe halogène et un détec-teur basé sur une technologie InGaAs étendue dans le visible, capable de produire des images dans trois bandes spectrales différentes s’étendant sur une plage spectrale allant de 530nm à 1700nm. Un montage achromatique, utilisant des objectifs de microscope à miroirs, est déve-loppé afin d’atteindre une résolution axiale ∼ 1,9µm dans chacune des trois bandes. Afin de garantir des performances similaires à celles de l’OCT plein champ conventionnel, un système