145 une image toutes les 10 ms afin de pouvoir observer au moins deux intensités différentes, pour

une même molécule, dans le champ évanescent avant le contact avec la membrane (Figure IV-18). Notre caméra actuelle ne nous permettant qu’une acquisition avec des temps d’exposition de 200 ms, il nous est impossible de réaliser ce type d’observation.

Une dernière information que l’on peut espérer obtenir à partir de l’utilisation de l’onde évanescente est le coefficient de diffusion de notre peptide. En effet, il nous est possible de repérer un peptide en x, y et z à chaque instant de donc de définir son déplacement quadratique moyen, paramètre qui est directement lié à la diffusion d’une molécule. Ainsi nous pouvons essayer de déterminer s’il existe 2 états de diffusion, un en solution et un lié à la membrane pour en déduire le temps de résidence moyen dans la bicouche avant translocation. Il est aussi possible de corréler ce temps moyen avec la traversée ou non de la bicouche.

2. Expérience d’extinction

Une deuxième façon d’utiliser ce montage pour observer la translocation est d’utiliser un extincteur de fluorescence dans l’un des deux compartiments afin de déterminer de quel côté se trouve notre peptide. L’utilisation d’extincteur se liant au fluorophore (comme des anticorps) est problématique car le peptide peut être est capable de traverser la bicouche avec la cargaison qui lui est attaché. Il se peut donc que les extincteurs de fluorescence traversent la bicouche à l’aide du peptide, maintenant l’extinction du signal quel que soit le compartiment dans lequel se trouve le peptide.

Il faut donc réaliser ces expériences avec un agent d’extinction présent dans le second compartiment. Ainsi nous pouvons suivre le peptide lors de son approche de la bicouche, et une fois celle-ci traversée nous perdons le signal de fluorescence de façon soudaine. Comme évoqué précédemment si nous voyons une diminution de l’intensité due à la décroissance en intensité du champ évanescent cela suggère que le peptide ne traverse pas, mais qu’il est arrêté par la bicouche. Cependant dans le cas où le peptide traverse de l’autre côté, alors celui-ci se retrouve associé à l’extincteur de fluorescence, ce qui induit son extinction brusque.

Une alternative est d’utiliser des molécules éteignant la fluorescence sans se lier au fluorophore, comme le bleu trypan. Par contre ces molécules sont généralement capables de diffuser lentement au travers des bicouches, ce qui impose aux expériences d’être réalisée sur des échelles de temps courts.

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3. Transfert d’énergie par résonance de Forster

Une dernière adaptation du montage consisterait en l’utilisation des techniques de transfert d'énergie par résonance de Forster (FRET, déjà introduit en I.F.3.b))

Cette technique peut être utilisée afin de palier le risque de traversée des extincteurs. Il est possible de marquer l’un des deux compartiments avec un fluorophore permettant d'observer du FRET en présence du peptide fluorescent.

Un tel montage reste cependant couteux car il est préférable en FRET de pouvoir suivre les deux fluorophores afin de pouvoir travailler simultanément en diminution locale de fluorescence pour le donneur, et en augmentation sur l’accepteur. Il faut donc posséder un montage sur lequel les longueurs d'onde d’excitation de chacun des fluorophores sont disponibles ainsi que les filtres associés.

4. TIRF avec émulsion

Une dernière perspective pour ce microscope serait de le combiner aux approches en gouttelettes développées au chapitre précédent (III). Dans cette configuration le compartiment inférieur contient toujours une solution de PBS saturée en saccharose, par contre le compartiment supérieur est rempli d’une solution de squalène saturée en lipides.

Sur une des électrodes de l’amplificateur électrique, préalablement couverte d’agarose, ayant permis les mesures de capacitances réalisées dans le chapitre précédent, est déposée une goutte de tampon contenant le CPP à la concentration voulue. L’électrode est ensuite amenée au fond de la chambre supérieur (Figure IV-19).

Mise au point d’un microscope pour l’observation de la translocation à l’échelle de la molécule unique - Perspectives pour l’étude de la translocation

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Figure IV-19 : Schéma de principe du microscope à évanescence sur bicouche suspendue à l’interface d’une émulsion inverse. Le détail de la bicouche est présenté dans l’encart.

Du fait de la présence des lipides dans l’huile, une monocouche se forme à chaque interface huile-eau, et lorsque la goutte atteint l’interface entre les deux compartiments, une bicouche se crée entre la goutte et le compartiment inférieur. La formation de la bicouche peut être suivie à la fois électriquement et optiquement.

Toutes les mesures proposées au cours de ce chapitre peuvent ainsi être réalisées sur ce système. Cependant cette expérience n’a pas encore été entreprise au moment de l’écriture.

Pour conclure, nous avons développé un microscope permettant d’observer des molécules uniques sur une bicouche suspendue en utilisant une illumination TIRF. Ce système nous a permis d’observer des CPP uniques aux abords d’un film noir avec un signal sur bruit convenable pour les distinguer (SNR ~ 1,4). Cependant, nous n’avons pas encore tenté d’observer la translocation à l’aide de ce microscope notamment car notre caméra n’est pas assez rapide pour l’observation en molécules uniques.

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V. Conclusion

Au cours de cette thèse, nous avons pu identifier un type de GAG, les HS, comme partenaire d’interaction de la pénétratine avec la membrane cellulaire, à l’aide de mesure de force. Nous avons aussi mis en évidence que les acides sialiques modifient le nombre de partenaires à la surface de la cellule en masquant des sites normalement non disponibles qui ne sont pas majoritairement des HS.

Nous avons pu mettre en évidence le phénomène de translocation de la pénétratine lié à un fluorophore à l’aide des bicouches à l’interface entre gouttelettes. Le mécanisme de translocation consiste en la formation de rares structures de perméation (unique ou quelques unités) dans la membrane, que nous n’avons pas tenté de caractériser. Nous avons vu que l’apparition de ces structures est facilitée par la présence de POPG dans la bicouche. Dans les bicouches contenant uniquement de la POPG, elles ont une probabilité d’apparition de 0,13 min-1 (sur des bicouches de ~ 103 µm2). Cette probabilité décroit progressivement jusqu’à être inférieure à 0,02 min-1 dans les bicouches ne contenant que 20% de POPG. Nous avons pu déterminer le coefficient de perméabilité après apparition de ces structures de perméation : P ~ 10-8 m.s-1. Nous avons montré que dans nos conditions les bicouches contenant uniquement de la POPC semblent instables puisqu’elles laissent passer le fluorophore seul.

Enfin, nous avons développé un montage expérimental de bicouche suspendue horizontale sur un microscope à réflexion totale permettant l’observation de CPP à l’échelle de la molécule unique sur la bicouche suspendue. Cet instrument n’a pas encore été utilisé pour observer le phénomène de translocation, car nous sommes limités par le matériel d’acquisition, mais l’instrument semble prometteur pour l’étude des CPP.

Nous espérons pouvoir continuer l’étude. Un objectif est d’établir le lien entre l’étape d’adhésion et la translocation des CPP. L’étape d’adhésion avec les HS a pu être caractérisée à l’aide du BFP. Par contre l’affinité des CPP pour les lipides chargés négativement n’a pas pu être détectée à l’aide de cet instrument. En revanche, cette affinité a été observée sur les expériences en bicouche à l’interface entre gouttelettes, où la pénétratine est localisée à la membrane lorsque la monocouche est composée exclusivement de POPG. Ces expériences en gouttelettes nécessitent par ailleurs d’être continuées afin de déterminer si la POPG joue un rôle spécifique favorisant la translocation, ou si d’autres lipides chargés négativement peuvent

Conclusion - Perspectives pour l’étude de la translocation

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