140 Le faisceau laser entre donc incliné vers le fond de la chambre, à l’aide d’un jeu de 3 miroirs

permettant un réglage précis. Le dernier miroir est maintenu sur une potence et son inclinaison ainsi que sa position sont ajustées afin de générer l’onde évanescente sur la membrane (Figure IV-13). L’espace entre la membrane et la lamelle permet d’observer les réflexions totales par la propagation du faisceau laser le long de la chambre. La position du laser est aussi suivie à l’aide du microscope en observant la réflexion de ce dernier sur le film de PTFE sans filtre, mais à l’aide d’un filtre de densité neutre pour atténuer son intensité.

Ce système nous a permis de réaliser des observations de molécule unique, avec un meilleur signal sur bruit que les observations réalisées à l’aide de l’objectif TIRF (1,2 contre 1,1 précédemment) (Figure IV-14). Cependant le bruit reste élevé, essentiellement car le faisceau laser éclaire une zone plus large que la membrane. Le ruban de PTFE ayant été étiré, il se peut que celui-ci soit partiellement transparent à la lumière, ce qui expliquerait la présence de fluorescence parasite excitée par la lumière diffusée au travers du PTFE. Une seconde source de lumière parasite pourrait être générée lors de l’entrée du laser dans la boite de pétri qui se fait par une réfraction au travers d’un plastique courbé, ce qui pourrait disperser le faisceau dans le compartiment inférieur.

Figure IV-14 : Observation en molécule unique à l’aide du TIRF par éclairement latéral. L’ellipse rouge est centrée sur une molécule unique. La barre d’échelle correspond à 10 µm. La courbe à droite représente l’évolution du rapport signal sur bruit le long du grand axe de l’ellipse. Le pic à 7 µm correspond à la présence d’une molécule fluorescente.

3. Support de membrane

Parmi les sources de bruit restant nous nous heurtions à l’épaisseur du PTFE qui était transparent au laser dans nos conditions. Le faisceau ayant un diamètre supérieur au millimètre alors que notre membrane possède un diamètre proche de 100 µm. Ainsi nous avons décidé de

Mise au point d’un microscope pour l’observation de la translocation à l’échelle de la molécule unique - Évolutions

IV-141 fabriquer un bouchon d’un millimètre d’épaisseur composé en PTFE. Ce bouchon est percé en son centre d’un diamètre de 500 µm. Ensuite le ruban devant accueillir la membrane est percé comme précédemment et est aligné sur le bouchon de PTFE. Ainsi nous réduisons la lumière transmise par le laser sur le diamètre percé dans le bouchon. Cette première réduction du bruit nous a permis une amélioration du contraste sur nos images.

4. Compartiment inférieur

Enfin l’autre source de bruit sur notre montage est la déviation du rayon au travers du bord courbé de la boite de pétri. Afin de supprimer la diffusion de lumière à ce niveau, nous avons décidé de façonner une chambre en inox dont l’un des côtés présente une vitre inclinée à 70° ce qui correspond à l’angle nécessaire pour la réflexion totale sur le film noir. Il fallait aussi aménager le fond de la chambre pour pouvoir y placer une lamelle de verre (Figure IV-15). Afin de pouvoir utiliser l’objectif TIRF, si souhaité, la lamelle est centrée dans la chambre et un débord de 100 µm d’épaisseur la recouvre sur ses bords. La lamelle est ensuite bloquée dans son logement à l’aide d’une bague en inox filetée aux dimensions de la lamelle. Un joint fin de PDMS peut être ajouté pour assurer l’étanchéité, si besoin.

Figure IV-15 : Schémas représentant les deux compartiments ayant été utilisés pour les expériences de TIRF. Le compartiment de gauche est en plastique, tandis que le compartiment de droite (celui sur le montage actuel) est conçu en inox. Les parties en bleu foncé représentent les lames de verre. Il y en a une dans le fond pour permettre l’observation et une latérale pour l’entrée du laser dans le compartiment.

À l’aide de ce système le faisceau se propage désormais de façon rectiligne dans le compartiment inférieur. Cependant le faisceau n'éclaire toujours pas la membrane seulement mais aussi le PTFE car son diamètre est trop grand : une autre amélioration possible consisterait à réduire le diamètre du faisceau incident pour limiter le bruit. Les images acquises ainsi restent utilisables pour une approche en molécule unique, comme le montrent les quelques acquisitions réalisées où l’on peut distinguer des peptides uniques sur la membrane avec un SNR de 1,4 qui semble satisfaisant pour distinguer aisément des molécules uniques (Figure IV-16).

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Figure IV-16 : Observation en molécule unique à l’aide du TIRF par éclairement latéral, et après modification du compartiment inférieur. L’ellipse rouge est centrée sur une molécule unique. La barre d’échelle correspond à 10 µm. La courbe à droite représente l’évolution du rapport signal sur bruit le long du grand axe de l’ellipse. Le pic à 4 µm correspond à la présence d’une molécule fluorescente.

5. Fibre optique

Un autre élément pouvant être amélioré concerne aussi bien le réglage de l’angle que le diamètre du faisceau sur la membrane. Afin d’obtenir une réflexion sur la membrane et non sur le film de PTFE nous avons décidé d’utiliser une fibre optique monomode pour guider le laser. Ainsi l'optique est dépourvue de figures d’interférences, et le diamètre du faisceau est réduit à la sortie de la fibre à l’aide de collimateurs. Nous avons ainsi pu diminuer la taille du faisceau à ~ 0,4 mm. Le montage actuel devrait nous permettre une observation en molécule unique sur bicouche suspendue avec un bruit minimisé, bien qu’aucune expérience n’ait encore été réalisée depuis l’ajout de la fibre optique.

Il demeure que notre système d’acquisition (sensibilité de la caméra et analyse des images) n’est pas encore optimal pour de l’observation en molécule unique. De plus par manque de temps je me suis arrêté à la conception et caractérisation du montage mais je n’ai pas pu réaliser d’étude de translocation à l’aide de ce montage. En revanche des idées d’approches ont été développées afin d’observer ce phénomène et seront décrites dans la partie suivante. Certaines de ces idées ont pu être mises en œuvre mais n’ont pas été reproduites suffisamment de fois pour permettre de conclure.

Mise au point d’un microscope pour l’observation de la translocation à l’échelle de la molécule unique - Perspectives pour l’étude de la translocation

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