115 Nous calculons le coefficient de perméabilité sur les premières minutes du passage, temps au

cours duquel la différence de concentrations entre les gouttelettes n’évolue au plus que de 10%, nous pouvons donc approximer cette différence de concentrations par la différence des concentrations initiales, c’est-à-dire la concentration initiale de la gouttelette « réservoir ». Ainsi :

𝑃= ^{4𝛼𝑉𝑐}

𝜋𝐷_𝐼²𝐶_𝑟(𝑡 = 𝑂)

(III.7) Les valeurs obtenues pour les coefficients de perméabilité dans chacune des conditions où nous observions de la translocation sont représentées dans le graphique Figure III-20. Nous avons pu extraire un coefficient de perméabilité pour la pénétratine-FP488 dans les membranes contenant des lipides anioniques (10-9 < P < 10-8 m/s).

Pour interpréter er ces valeurs nous les avons comparées à des valeurs connues de perméabilité ionique : le coefficient de perméabilité de la pénétratine sur la bicouche 100% POPG est plusieurs ordres de grandeur au-dessus de celui des ions Na+(P ~ 10-16) et Cl- (P ~ 10-12) au travers de vésicules de 100% POPC ou de 100% POPS (Paula et al. 1998) (Hauser et al. 1972). Pour rappel, le coefficient de perméabilité de l’eau sur ces modèles est de 10-4 m.s-1 (Mansy 2010).

Figure III-20 : Graphique représentant les coefficients de perméabilité mesurés pour la pénétratine-FP488 et FP488 seul en fonction de la proportion de POPG dans la membrane des DIB. Ces valeurs sont mises en perspective avec les coefficients de perméabilité des ions Na+ et Cl- mesurés dans des GUV de compositions similaires (POPC ou POPS) (Hauser et al. 1972).

1,0E-17 1,0E-16 1,0E-15 1,0E-14 1,0E-13 1,0E-12 1,0E-11 1,0E-10 1,0E-09 1,0E-08 0% 20% 40% 60% 80% 100% C oe ff ic ien t d e p er méa b ilit é (m. s -1 )

Concentration en lipides anioniques dans la bicouche

pénétratine -FP488 FP488

III-116

E. Conclusion

Les expériences en DIB présentent donc un système modèle approprié pour l’observation de la translocation des CPP, et nous avons pu observer le passage de la pénétratine au travers de bicouches contenant au moins 40% de POPG que nous interprétons comme de la translocation. Nous avons montré que l’efficacité de la translocation est corrélée à la concentration en lipides anioniques (POPG) dans la bicouche. À mesure que cette quantité diminue, la translocation aussi, et en-deçà de 20% de POPG, le fluorophore FP488 seul traverse la bicouche avec la même efficacité que lorsqu'il est lié à la pénétratine. Enfin, en l'absence de lipides anioniques, la sonde est capable de traverser la bicouche pendant les 30 minutes d’observation, suggérant que les bicouches uniquement composées de POPC sont peu stables.

Cette observation n’est pas liée à une modification du coefficient de perméabilité qui reste à peu près le même pour la pénétratine dans toutes les conditions lipidiques, aussi bien pour la pénétratine que pour la sonde seule (10-9 m.s-1 < P < 10-8 m.s-1). Cette valeur est intermédiaire entre celle des ions et celle de l’eau.

En revanche, la probabilité de formation d’un défaut dans la membrane, pour la pénétratine, augmente avec la concentration en POPG jusqu’à 13% par minute en 100% POPG, tandis qu’elle est constante et inférieure à 1% pour le fluorophore seul au-dessus de 40% POPG. La bicouche composée uniquement de POPC montre pour le fluorophore seul une probabilité élevée de formation de défaut, soulignant surement un défaut de stabilité de nos membranes pour cette composition.

Nous avons donc mis en évidence que le passage de la pénétratine est d’autant plus favorisé que la membrane contient des lipides anioniques, et ce que ce passage est permis par l’apparition de rares défauts (unique ou quelques unités) dans la membrane. La probabilité d’apparition de défauts dans la membrane augmente avec la concentration en lipides anioniques et le passage de la pénétratine, une fois les défauts apparus, se fait avec un coefficient de perméabilité P de l'ordre de 10-9 à 10-8 m.s-1.

Étude de la translocation à l’aide de bicouches à l’interface entre gouttelettes - Perspectives

III-117

F. Perspectives

L’étude développée ci-dessus en reste à un stade qui nécessite encore quelques expériences pour avoir une meilleure valeur statistique. Bien que la preuve de concept sur l’étude des CPP soit satisfaisante, nous apportons des réponses ne concernant qu'un seul CPP : la pénétratine. De plus, nous n’avons travaillé qu’avec des membranes dont le cœur hydrophobe est composé uniquement des chaines palmitoyl-oeloyl. Pour généraliser les résultats présentés ci-dessus il peut être intéressant de complexifier nos membranes en termes d’asymétrie et de composition.

1. Membranes asymétriques

Un point fort de l’utilisation des émulsions adhésives est la possibilité de changer la composition lipidique aisément entre chaque expérience. Le coût par expérience reste abordable permettant de travailler sur des mélanges différents. Enfin, chaque gouttelette se couvre d’une monocouche de lipides dépendante du mélange huile-lipide au moment de la formation de l’émulsion.

Ainsi il est possible de réaliser deux populations de gouttelettes, chacune avec sa composition lipidique propre. Afin de distinguer les deux types de gouttelettes, une composition lipidique sera marquée par la présence d’un fluorophore soluble, et on cherche les paires asymétriques en fluorescence dont la bicouche séparatrice sera aussi asymétrique en matière de composition lipidique. Nous pourrions aussi envisager une approche alternative à la formation de DIB à l’aide de gouttelettes contenant des vésicules (Hwang et al. 2008). Cependant, dans le cadre de l’étude des CPP, il se peut que les SUV présentent dans les gouttelettes interagissent avec les CPP rendant l'expérience plus difficile à interpréter.

Cependant, il reste à prouver la stabilité d’une telle asymétrie.

Cette stabilité n’a pas encore été étudiée, mais elle doit pouvoir être mesurée. Il n’est pas possible d’utiliser des lipides fluorescents pour étudier l’asymétrie, car les lipides sont en excès dans le mélange d’huile ce qui induit un bruit de fond trop important pour une observation satisfaisante de la membrane.

Une autre méthode reposant sur l'utilisation de l'annexine V marquée par un fluorophore est envisageable. L’annexine V est une protéine membranaire périphérique qui, en présence de calcium, se lient aux têtes PS de la membrane (Mukhopadhyay & Cho 1996). Ainsi afin d’observer l’asymétrie de nos gouttelettes nous pouvons travailler sur une asymétrie simple, avec une population formée en POPS, et la seconde en POPC.

III-118