II.1 Caractérisation du contenu protéique
La liste des protéines contenues dans les exosomes de myoblastes et myotubes C2C12 a été obtenue par spectrophotométrie de masse. Respectivement, 318 et 375 protéines ont été identifiées dans les exosomes sécrétés par les myoblastes et les myotubes. Parmi les différentes protéines identifiées, 244 protéines ont été retrouvées à la fois dans les 2 types d’exosomes. L’analyse de la fonction de ces protéines a permis de déterminer qu’elles étaient significativement impliquées dans la formation, le transport et la localisation intracellulaire des vésicules, des endosomes précoces et tardifs (plateforme intégrative Babelomics 4.0 (http://babelomics.bioinfo.cipf.es). Etant donné que la biogenèse des exosomes est corrélée à la voie endosomale, ces observations confirment à nouveau que les nanovésicules sécrétées par les cellules musculaires au cours de la myogenèse sont majoritairement des exosomes.
Parmi les différentes protéines présentes dans les exosomes sécrétés par les myoblastes et les myotubes, 23 protéines sont spécifiques du muscle. Cette donnée
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suggère que le muscle strié squelettique sécrète des exosomes spécifiques qui contiennent, en plus des protéines caractéristiques des exosomes, des protéines spécifiques du tissu cellulaire qui les sécrète.
Liste des 23 protéines musculaires présentes dans les exosomes sécrétés par les myoblastes et les myotubes
ACTC1 actin, alpha, cardiac muscle 1
ATP2A1 ATPase, Ca++ transporting, cardiac muscle, fast twitch 1 ATP2A2 ATPase, Ca++ transporting, cardiac muscle, slow twitch 2 CAMK2G calcium/calmodulin-dependent protein kinase II gamma CAPZB capping protein (actin filament) muscle Z-line, beta CASQ1 calsequestrin 1 (fast-twitch, skeletal muscle) CASQ2 calsequestrin 2 (cardiac muscle)
CRYAB crystallin, alpha B
DAG1 dystroglycan 1 (dystrophin-associated glycoprotein 1) DES desmin
FLNC filamin C, gamma
ITGB1 integrin, beta 1 (fibronectin receptor, beta polypeptide, antigen CD29 includes MDF2, MSK12) NES nestin
RHOA ras homolog family member A
SGCA sarcoglycan, alpha (50kDa dystrophin-associated glycoprotein) SGCD sarcoglycan, delta (35kDa dystrophin-associated glycoprotein)
SNTB1 syntrophin, beta 1 (dystrophin-associated protein A1, 59kDa, basic component 1) SNTB2 syntrophin, beta 2 (dystrophin-associated protein A1, 59kDa, basic component 2) TLN1 talin 1
TTN titin UTRN utrophin VCL vinculin VIM vimentin
Respectivement 25 et 71 protéines n’ont été retrouvées que dans les exosomes de myoblastes ou de myotubes suggérant qu’elles auraient un rôle au cours de la myogenèse (Guescini, Guidolin et al. 2010). Parmi ces protéines, les protéines SGCA et DAG1 qui ont été identifiées uniquement dans les myotubes (Kislinger, Gramolini et al. 2005), sont également retrouvées uniquement dans les
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exosomes des myotubes. Une analyse bioinformatique a permis de déterminer que les 71 protéines spécifiques des myotubes sont impliquées dans la contraction musculaire, et dans le transport des ions calcium nécessaires aux cellules musculaires différenciées.
L’étude des interactions protéine-protéine des tétraspanines et des intégrines à la surface membranaire des exosomes sécrétés au cours de la myogenèse (logiciel STRING 9.0, http://string-db.org), a permis de mettre en évidence une évolution de ce réseau protéique (décrit comme étant probablement impliqué dans la reconnaissance et la capture des exosomes) à la membrane des exosomes sécrétés par les cellules prolifératrices par rapport aux cellules différenciées (apparition des intégrines ITGB1, ITGB5 et de la tétraspanine TSPAN8 à la membrane des exosomes de myotubes). Cette réorganisation de l’architecture protéique à la membrane des exosomes durant la différenciation des myoblastes en myotubes pourrait participer à leur action biologique, tributaire de leur reconnaissance et capture par une cellule cible (Thery, Zitvogel et al. 2002; Rana and Zoller 2011;
Rana, Yue et al. 2012). Dans ce sens, les exosomes sécrétés par les cellules musculaires de la lignée C2C12 expriment des marqueurs d’adhésion spécifiques (ITGB1, NCAM, CD9, CD81, CD44 et myoferline), impliqués dans la reconnaissance et l’adhésion des myoblastes lors de leur fusion pour former les cellules musculaires différenciées (Gu, Wang et al. 1994; Charlton, Mohler et al. 2000; Schwander, Leu et al. 2003; Mylona, Jones et al. 2006; Grabowska, Szeliga et al. 2011; Posey, Pytel et al. 2011).
II.2 Caractérisation du contenu en acides nucléiques
Comme le contenu protéique des exosomes varie selon que les exosomes sont sécrétés par les myoblastes ou les myotubes, et que les miARNs sont différentiellement exprimés et impliqués au cours de la myogenèse, nous avons émis l’hypothèse que le contenu exosomal en miARNs pourrait aussi varier au cours de la myogenèse. Les mêmes échantillons qui ont permis les analyses protéomiques, ont été utilisés pour la caractérisation de la composition en miARNs des exosomes sécrétés par les myoblastes et les myotubes.
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Les résultats obtenus ont permis de confirmer les données de la littérature : trois populations de miARNs sont observées selon qu’ils sont exportés ou non dans les exosomes et détectés ou non dans le cytoplasme de la cellule sécrétrice (Valadi, Ekstrom et al. 2007; Skog, Wurdinger et al. 2008; Taylor and Gercel-Taylor 2008;
Rabinowits, Gercel-Taylor et al. 2009; Kogure, Lin et al. 2011; Mittelbrunn, Gutierrez-Vazquez et al. 2011; Hu, Drescher et al. 2012; Kharaziha, Ceder et al. 2012).
La majorité des miARNs retrouvés dans les cellules musculaires sont exportés dans les exosomes. Sur les 196 miARNs détectés dans les myoblastes, 168 sont exportés via les exosomes (84%). Seuls 3 miARNs ne sont uniquement retrouvés que dans les exosomes (mmu-miR-302c*, mmu-miR-544, rno-miR-207). 208 miARNs ont été identifiés dans les myotubes, dont 180 sont également retrouvés dans les exosomes sécrétés par la cellule (86%). Seuls 2 miARNs ne sont uniquement retrouvés que dans les exosomes sécrétés par les myotubes (mmu-miR-673-3p, rno-miR-207). Parmi les 28 miARNs qui ne sont jamais exportés dans les exosomes, 8 sont à la fois retrouvés dans le cytoplasme des myoblastes et des myotubes (miR-147, miR-30b*, miR-467c, miR-615-3p, miR-669a, miR-677, miR-28*
and miR-29-2). Ces résultats, croisés aux données obtenues dans d’autres lignées cellulaires, permettent de confirmer que différentes classes de miARNs sont exprimées par les cellules, selon qu’ils soient exportés ou non (Valadi, Ekstrom et al.
2007; Montecalvo, Larregina et al. 2012).
Parmi les miARNs identifiés dans les exosomes, 21 miARNs sont également retrouvés dans les exosomes quel que soit le type et le statut cellulaire (mastocytes et cellules dendritiques matures et immatures) (Valadi 2007, Montecalvo 2012). De la même manière, miR-147, miR-467c et miR-669a qui ne sont pas retrouvés dans les exosomes sécrétés par les cellules musculaires, ne sont jamais exportés dans les exosomes de cellules dendritiques. Ces résultats suggèrent que l’incorporation des miARNs dans les exosomes serait régulée, permettant de trier spécifiquement les miARNs destinés à l’export (Mittelbrunn 2011, Kosaka N. 2011).
Parmi tous les miARNs caractérisés, certains sont spécifiques du muscle (myomiR). Ils sont différentiellement exprimés au sein de la cellule au cours de la myogenèse, régulant ainsi la différenciation myogénique des cellules prolifératrices en cellules plurinuclées (Ge and Chen 2011). Lors de la différenciation des myoblastes en myotubes, 108 miARNs sont différemment exprimés au sein de la
Myoblastes en prolifération
48h de prolifération dans un milieu
dépourvu d’exosomes
Filtration 0.22 µ µ µ µ m des milieux conditionnés récupérés
Exosomes sécrétés par les myoblastes
Milieu conditionné complet Milieu conditionné
dépourvu en exosomes sécrétés
Myotubes différenciés
48h de différenciation dans un milieu
dépourvu d’exosomes
Exosomes sécrétés par les myotubes
Milieu conditionné complet Milieu conditionné
dépourvu en exosomes sécrétés
Figure 30 Les trois fractions de milieux conditionnés des myoblastes et des myotubes utilisés
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cellule. 48 sont up-régulés ; parmi eux les myomiRs : miR-1, miR-133a, miR-133b, miR-206, et 60 sont down-régulés. Dans un premier temps, cette expression différentielle cytoplasmique a été comparée à l’expression différentielle des miARNs exportés dans les exosomes sécrétés par les myoblastes et les myotubes. La comparaison des miARNs présents dans les exosomes sécrétés par les cellules prolifératrices et différenciées a permis de mettre en évidence que 86 miARNs exportés sont différemment exprimés selon le statut physiologique de la cellule.
Parmi les 39 miARNs up-régulés, 18 le sont également au sein de la cellule ; de même 19 miARNs sur 47 sont down-régulés à la fois dans les exosomes et dans les cellules. De façon intéressante let-7d est régulé à l’envers dans les exosomes par rapport au cytoplasme : up-régulé dans la cellule et down-régulé au sein des exosomes sécrétés.