I.1 Utilisation d’un milieu de culture dépourvu en exosomes du sérum
Afin de récupérer uniquement les exosomes sécrétés par le type cellulaire étudié, il est nécessaire de s’affranchir des exosomes déjà présents dans les milieux de culture utilisés lors de la culture cellulaire. Présents dans les sérums de veau fœtal (SVF) et de cheval (Horse Serum, HS) qui sont utilisés respectivement pour la prolifération des myoblastes et leur différenciation en myotubes, les milieux de culture ont été ultracentrifugés une nuit à 100.000g. Le surnageant récupéré a été filtré (Milieu Sans Exosomes, MSE, ou DED, DMEM Exosome-Depleted dans l’article 1) et utilisé pour la collecte des milieux conditionnés de myoblastes et de myotubes.
Toutefois, les myoblastes de la lignée C2C12 se différencient spontanément dès lors que les cellules sont confluentes. Afin d’éviter que la collecte des exosomes sécrétés par les myoblastes ne coïncide avec un début de programme de différenciation myogénique, les exosomes ont été isolés à partir des milieux de
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culture de myoblastes dont la confluence était inférieure à 60%. A l’inverse des myoblastes, il n’y a pas de contraintes de culture pour les myotubes de la lignée C2C12 qui, une fois différenciés, se maintiennent plusieurs jours. C’est pourquoi, l’incubation des myotubes avec le milieu MSE correspondant a été réalisée une fois les cellules bien différenciées, soit 5 à 7 jours après l’initiation de la différenciation.
Etant donné que les milieux de culture utilisés ne contenaient plus les exosomes du sérum, il a fallu au préalable s’assurer que ces milieux ne perturbaient pas la prolifération des myoblastes et leur différenciation en myotubes. L’appareil mis au point par le groupe Roche, le « xCELLingence RTCA DP », a permis de s’assurer que le milieu MSE de prolifération ne perturbait pas la croissance des myoblastes.
Cet appareil permet de suivre en temps réel l’occupation des puits par les cellules ensemencées grâce à l’évaluation de l’impédance fournie par les cellules, en réponse à une impulsion électrique régulière. La comparaison de l’évolution de l’occupation des puits par les cellules incubées dans le milieu classique de prolifération et celui sans les exosomes du sérum a permis d’établir que dans les deux cas les cellules se comportaient façon similaire.
Toutefois, étant donné que l’appareil ne mesure que l’impédance, on ne peut savoir si le signal est représentatif du nombre de cellules (prolifération cellulaire) ou s’il s’agit d’une augmentation de la taille des cellules. Une observation au microscope optique a permis dans un premier de temps de visualiser que la morphologie des cellules était identique, quel que soit le milieu de culture utilisé. Puis cette observation microscopique a été confirmée par l’utilisation du « Scepter 2.0 Handheld automated cell counter » (Millipore) qui a permis de déterminer que les myoblastes avaient la même taille, quel que soit le milieu de culture utilisé. Enfin, le temps de doublement des myoblastes a été calculé. Il en résulte qu’avec ces deux types de milieu de culture, les cellules se divisent toutes les 15 heures environ.
Concernant le milieu de culture dépourvu en exosomes de sérum de cheval pour la culture des myotubes, une observation au microscope optique a été réalisée et a permis de visualiser la présence de cellules plurinuclées, allongées et l’absence de mortalité cellulaire.
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I.2 Isolement des exosomes sécrétés par les myoblastes et les myotubes
Après l’isolement des exosomes sécrétés par les myoblastes et les myotubes à partir des milieux conditionnés respectifs, selon la méthode de centrifugations différentielles la plus décrite dans la littérature (Thery, Amigorena et al. 2006), il était nécessaire de s’assurer de la présence d’exosomes et de la qualité de la préparation. Le recours à trois techniques expérimentales a permis de considérer les vésicules extraites comme des exosomes.
Dans un premier temps, la granulométrie a permis de déterminer la distribution de tailles des nanovésicules sécrétées par les myoblastes et les myotubes. Dans les deux cas, la population est homogène (distribution en courbe de Gauss), dont la taille moyenne des vésicules est comprise entre 110 et 120 nanomètres, correspondant à la taille des exosomes étudiés et décrits dans différentes précédentes études (Thery, Boussac et al. 2001; Thery, Amigorena et al.
2006). La taille des nanovésicules a également été confirmée en microscopie électronique à transmission (Lamparski, Metha-Damani et al.). Cette technique expérimentale a également permis de déterminer que les vésicules isolées expriment les marqueurs protéiques membranaires (CD63) et luminal (Tsg101) caractéristiques des exosomes, par l’utilisation d’anticorps spécifiques couplés à des billes d’or.
Enfin, la technique de Western Blot a également permis d’établir un enrichissement des marqueurs protéiques caractéristiques des exosomes (CD63, CD81, Tsg101 et Alix) par rapport au contenu protéique de la cellule. Le Western Blot a également permis de confirmer la qualité des exosomes extraits : les marqueurs caractéristiques du réticulum endoplasmique (calnexine) et de la mitochondrie (les différentes sous unités du complexe OXPHOS) ne sont pas retrouvés dans les préparations.
De la même façon, la caractérisation du contenu protéique par spectrométrie de masse en tandem a, par la suite, confirmé l’origine endosomale des vésicules sécrétées et isolées par ultracentrifugation : parmi les protéines caractérisées dans les sécrétomes des myoblastes et des myotubes, 25 d’entre elles sont fréquemment retrouvées dans la liste des protéines contenues dans des exosomes isolés de différents types cellulaires (Mathivanan, Fahner et al. 2012).
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Cependant, lors de l’analyse protéomique nous avons identifié 7 protéines de la famille des histones (Hist1h1c, Hist1h1d, Hist1h1b, Hist1h1e, Hist1h4a, Hist1h3b, Hist1h3a). La protéine Hist1h4a est la troisième protéine la plus abondante dans le listing des protéines identifiées dans les exosomes de myoblastes. Il est actuellement admis que les histones sont des marqueurs des corps apoptotiques (Thery, Ostrowski et al. 2009). Ceci suggère que malgré toutes les précautions prises, nous avons été contaminés, lors de l’isolement des exosomes, par d’autres types de vésicules. En effet, lors de la différenciation des myoblastes de la lignée C2C12, la sortie du cycle cellulaire est associée à une augmentation de la mortalité cellulaire (Thery, Amigorena et al. 2006). C’est pourquoi, les exosomes sécrétés par les myoblastes ont été isolés à partir de culture cellulaire dont la confluence n’excédait pas 70% de la surface d’ensemencement. La présence d’histones (isoformes H1 et H4) dans les préparations d’exosomes utilisant d’autres méthodes de purification a aussi été notifiée dans les publications de (Valadi, Ekstrom et al.
2007; Mathivanan, Lim et al. 2010).
De la même manière, de nombreuses protéines retrouvées dans les exosomes sécrétés par les cellules musculaires, sont des composants de la matrice extracellulaire. Parmi ces protéines, on retrouve les collagènes (Col12a1 Col6a1 Col6a2), les protéoglycannes (hspg2, Sdc4, Ogn, Vcan), les métalloprotéinases (MMP2), les laminines (Lama5). Ces protéines, à priori non contenues dans les exosomes, auraient été précipitées en même temps que les exosomes lors des étapes d’ultracentrifugation, et n’auraient pas été éliminées lors de l’étape de lavage au PBS. Plusieurs publications suggèrent que d’autres techniques d’isolement des exosomes basées sur des centrifugations sur gradient/coussin de sucrose (densités égales à 1.20 g/ml) ou basées sur l’immuno-affinité, permettraient d’éliminer les protéines contaminantes (sérum, débris cellulaire et protéines de la membrane extracellulaire) des préparations (Ostrowski, Carmo et al. 2010; Atay, Gercel-Taylor et al. 2011). Cependant, il semblerait que ces techniques expérimentales ne soient pas non plus optimales pour l’isolement des exosomes et ne permettraient pas d’obtenir une meilleure pureté des préparations. En effet, les protéines de la matrice extracellulaire (Col12A1, Lama5, hspg2) et de la famille des histones sont également retrouvées dans les publications où les exosomes ont été isolés par des techniques d’immuno-affinité ou de centrifugations sur gradient de sucrose (Valadi, Ekstrom et al. 2007; Mathivanan, Lim et al. 2010). De la même manière, en utilisant les
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marqueurs CD63 et CD9, considérés spécifiques des exosomes, une population vésiculaire hétérogène en taille est isolée par immuno-affinité (Bobrie 2012). Le marqueur CD9 est également retrouvé à la membrane de grosses vésicules qui sont précipitées à de faibles vitesses de centrifugations (microparticules). De la même manière, des vésicules qui expriment le marqueur CD63 sont également retrouvées à des densités supérieures à 1.20 g/ml lors de l’isolation des exosomes sur gradient de sucrose. Ces résultats semblent indiquer que ces marqueurs protéiques ne puissent être considérés comme spécifiques des vésicules issues des endosomes et de nouvelles techniques sont nécessaires pour un isolement plus efficace des exosomes.