La première technique utilisée pour l’identification des substrats est le SILAC. Bien que cette méthode ne soit pas particulièrement adaptée pour les protéases, nous l’avons utilisée initialement pour une raison de proximité, car nous pouvions rapidement mettre au point les conditions expérimentales et faire l’analyse des résultats à la plateforme de protéomique du département d’immunologie et de biologie cellulaire de l’Université de Sherbrooke.
Figure 22 : Schéma expérimental de l’approche SILAC
Les cellules HCT-116 CASP3/7 KO ont été cultivées dans deux milieux de culture isotopique différents (léger : R0K0 ; médium : R6K4). L’apoptose a été induite dans les cellules misent en culture dans le milieu médium. Les cellules des deux conditions ont été récoltées et lysées. Les deux échantillons ont été mélangés et digérés à la trypsine pour ensuite être analysés par spectrométrie de masse tandem. Figure réalisée avec BioRender.com.
Substrat potentiel de la caspase-8
Dans l’approche SILAC, seulement les cellules HCT-116 CASP3/7 KO ont été utilisées (Figure 22). L’apoptose a été induite avec 100 ng/ml de TRAIL durant 3 heures dans les cellules qui ont été cultivées dans le milieu médium (R6K4) et celles qui ont été cultivées dans le milieu léger (R0K0) n’ont subi aucun traitement. Les cellules ont ensuite été récoltées et analysées par spectrométrie de masse tandem. Si la présence d’un peptide n’est pas influencée par l’apoptose, il possédera un ratio médium/léger égal à 1 et ne sera pas considéré comme un substrat potentiel. Les peptides ayant des ratios plus grands ou plus petits que 1 montrent qu’il y est possible que l’activité des caspases module la présence de ceux-ci. Les peptides avec un ratio médium/léger supérieur à 1 peuvent provenir de potentiels substrats de la caspase-8, car ils sont plus abondants dans les cellules traitées avec le TRAIL. Comme ces peptides n'existeraient pas en l’absence de l’activité des caspases, cela explique qu’ils se trouvent majoritairement dans l’échantillon traité au TRAIL. Les peptides avec un ratio inférieur à 1 peuvent être dus à l’activité des caspases qui, en clivant une protéine, empêche la formation d’un peptide précédemment identifié et génèrent des peptides qui ne sont pas détectables en protéomique.
Figure 23 : Schéma à l’échelle des différentes classes de peptides détectés en spectrométrie de masse – SILAC
L’analyse de spectrométrie de masse a permis d’identifier 11 741 peptides et 5293 de ceux-ci avaient un ratio MÉDIUM/LÉGER > 1. Parmi ces derniers, 11 possèdent un résidu aspartate (D) en P1.
Tableau 4 : Protéines identifiées avec l’approche SILAC qui possèdent un site de clivage suivant un résidu aspartate
Ratio MÉDIUM/LÉGER
normalisé
Nom du
gène Nom de la
protéine Site de
clivage Fonction de la
protéine Localisation cellulaire 4,04 KMT2D Histone-lysine
N-methyltransferase
2D AAKD-L Remodelage de
la chromatine Noyau 1,67 TRIM10 Tripartite
motif-containing protein 10
DEFD-L Différenciation des cellules
sanguines
Cytoplasme
1,39 ACTA2 Actine alpha 2 ELPD-G Structure et mouvement
cellulaire Cytosquelette 1,38 GAPDH
Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase
VIHD-N Participe à la glycolyse
Cytosol, cytosquelette
et noyau 1,38
PFN1 Profiline-1 VIRD-S Lie l’actine et module le cytosquelette
Cytoplasme et cytosquelette
1,28 LLQD-G
1,19 RAB1A Ras-related
protein Rab-1A EFAD-S
Trafic membranaire intracellulaire
Cytosol, endosome,
Golgi et membrane plasmique
1,18 CAND1
Cullin-associated NEDD8-dissociated
protein 1
LKID-A Ubiquitine des protéines
Cytoplasme et noyau
1,14 SULT1A
3 Sulfotransférase
1A1 FDAD-Y Sulfonation des
protéines Cytoplasme
1,11 LHPP
Phospholysine phosphohistidine
pyrophosphate
phosphatase VIAD-A
Hydrolyse divers substrats
possédant un diphosphate
Cytoplasme et noyau
1,02 CSNK2
A1 Sous-unité de la
caséine kinase II EALD-F
Cycle cellulaire et infection
virale Noyau
Les informations sur la fonction et la localisation proviennent d’UniProt (https://www.uniprot.org/). Les sites de clivage en gras sont ceux qui correspondent le mieux au site de clivage préférentiel de la caspase-8.
L’analyse de spectrométrie de masse nous a permis d’obtenir 11 741 peptides. De ceux-ci, 5293 peptides avaient un ratio médium/léger supérieur à 1 et 11 de ces peptides possèdent un résidu aspartate en P1, mais seulement 4 possèdent un site de clivage susceptible d’être clivé par la caspase-8 (Figure 23). Parmi ces 4 peptides, deux provenaient de la même protéine, la profiline-1 (PFN-1) et montraient certains des ratios les plus élevés, quoi qu’en deçà du seuil généralement utilisé de 1,5. La profiline-1 était
la seule à posséder en P1’ les acides aminés préférentiels à cette position, soit la glycine, alanine et sérine (Stennicke et al., 2000). De plus, cette protéine a été identifiée avec deux peptides, augmentant la certitude qu’elle avait été réellement observée et n’était pas simplement un artéfact (Tableau 4). C’est pour toutes ces raisons que nous avons testé s’il était possible d’observer le clivage de la profiline-1 in cellulo (Figure 24). Pour ce faire, l’apoptose fut induite de deux façons, soit le TRAIL et la staurosporine (STS), un inhibiteur non sélectif des protéines kinases. Afin d’affirmer qu’il y avait bien le clivage de la profiline-1, l’observation d’un fragment de clivage est importante. Puisque les deux sites de clivages identifiés se trouvent au centre de la protéine, un anticorps reconnaissant l’extrémité C-terminal fut choisi. Cependant, il fut impossible d’observer le fragment clivé, autant dans les cellules traitées au TRAIL qu’à la STS.
Figure 24 : Validation in cellulo du clivage de PFN1
Les CP et cellules HCT-116 CASP3/7 KO ont été traitées avec différentes concentrations de STS durant 24 h (A) ou avec différentes concentration de TRAIL durant 6 h (B) afin d’induire l’apoptose. Pour chaque condition, la profiline-1 a été détectée par immunobuvardage avec la protéine HSP90 comme contrôle de chargement.
Bien qu’il n’ait pas été possible d’observer le fragment clivé de la profiline-1, il était intéressant d’investiguer la profiline-2 (PFN-2) qui possède les mêmes sites de clivage que ceux identifiés par spectrométrie de masse pour la profiline-1. Les mêmes tests d’apoptose ont été faits et comme il est possible de le voir à la Figure 25, le traitement à la STS semble réduire le niveau de la profiline-2, mais il n’a pas été possible d’observer le fragment clivé. Les cellules traitées au TRAIL n’ont pas montré de diminution importante de la profiline-2 ni l’apparition d’un fragment clivé.
B A
Figure 25 : Validation in cellulo du clivage de PFN2
Les CP et les cellules HCT-116 CASP3/7 KO ont été traitées avec différentes concentrations (A) de STS durant 24 h ou (B) de TRAIL durant 6 h afin d’induire l’apoptose. Pour chaque condition, la profiline-2 a été détectée par immunobuvardage avec la protéine HSP90 comme contrôle de chargement.
3.10 Identification des substrats de la caspase-8 dans les HCT-116 CASP3/7 KO –