Identification génotypique

La deuxième méthode d’identification utilisée est basée sur des techniques qui permettent le décryptage du génotype, Il s’agit de l’amplification par PCR et le séquençage du gène codant pour l’ARNr 16S. C’est l’une des méthodes les plus appliquées pour obtenir une identification précise. Elle est fondée sur les relations phylogénétiques entre bactéries en comparant une partie stable de leur code génétique (Woese et al., 1985 ; Woese, 1987).

Après extraction de l’ADN de 15 isolats de lactobacilles isolés à partir des miels suivis d’une amplification du gène codant pour l’ARNr 16 S par PCR, la taille des amplicons obtenus pour chaque échantillon a été vérifiée et visualisée sur gel d’agarose par électrophorèse. Les résultats obtenus sont illustrés dans la figure 84.

L’analyse du produit de PCR a montré chez toutes les souches l’apparition d’une bande nette et claire d’ADN sur le gel (une bande dans chaque puits) qui définit l’amplification d’un seul fragment d’ADN de 1500 pb, et elle correspond exactement à la taille attendue justifiant ainsi la pertinence de cette démarche expérimentale. On constate toutefois une légère différence dans leurs intensités (épaisseur), ce qui signifie une différence de rendement d’extraction pour chaque isolat. Par ailleurs, la méthode d’extraction d’ADN utilisée a montré une fiabilité importante, car elle nous a donné des rendements élevés avec une bonne pureté de l’ADN génomique des isolats, ainsi elle est rapide et ne nécessite pas beaucoup d’étapes, ni d’utilisation de solvants chimiques dangereux (phénol...)

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Une fois avoir prouvée que l’amplification est correcte pour chaque échantillon, par électrophorèse, les amplicons de PCR ont été séquencés. Les mêmes amorces utilisées pour la PCR ont été également utilisées pour le séquençage. Les résultats des chromatogrammes de séquençage ont été analysés avec le programme de bio-informatique Chromas Lite 2.0, qui nous a permis de passer l’information à partir du séquençage de chaque chaine au format FASTA. Les séquences de chaque échantillon examiné ont été comparées à d’autres souches de référence existant dans la base de données NCBI GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) à l’aide de l’outil

BLAST. Après avoir confirmé l’identité des isolats, le pourcentage maximum d’homologie des espèces avec la GenBank a été établi. Comme il est montré dans l’annexe 06, les résultats du séquençage de 14 Lactobacilles isolées de miels nous ont permis d’identifier les espèces

lactobabacillus plantarum (11 isolats), Lactobacille pentosus (3 isolats) et un Lactobacillus sp.

Avec des degrés d’homologie de 99 à 100%. Cette technique a donc montré une plus grande efficacité par rapport à la spectrométrie de masse qui s’est arrêtée au niveau du genre pour l’identification. La partie d’ADN actuellement la plus communément utilisée pour la taxonomie bactérienne est le gène ARNr 16S (Bottger, 1989 ; Garrity et Holt, 2001). La séquence du gène ARNr 16S est déterminée chez un grand nombre de bactéries et souches, et fait l’objet d’un enrichissement exponentiel des bases de données. Ainsi, par exemple dans la plus grande base de données, GenBank (NCBI), sur les 20 millions de séquences déposées, 90 000 sont des séquences du gène 16S rRNA (Clarridge, 2004).

Notre étude a révélé la prédominance des lactobacillus plantarum suivi des

lactobacillus pentosus. Plusieurs souches de lactobacillus plantarum et lactobacillus pentosus

ont été isolées à partir de différentes niches écologiques (Vasiee et al., 2014 ; Agaliya et Jeevaratnam, 2014 ; Powthong et Suntornthiticharoen, 2015 ; Aarti et al., 2016 ). Ces deux espèces de lactobacilles sont génétiquement proches et présentent des phénotypes très similaires

(Tajabadi, et al., 2013) . L. plantarum est utilisé en stade final de la fermentation des fruits et

légumes en raison de sa tolérance accrue à l’acide par rapport aux autres bactéries lactiques

(Fleming, 1982). De plus, L. plantarum a été utilisé comme starter dans le pain au levain, les

produits carnés et le vin. Ses souches peuvent également avoir des caractéristiques probiotiques et potentiellement plusieurs applications bio-thérapeutiques (Powthong et Suntornthiticharoen,

2015). L. plantarum a une tolérance élevée à un pH bas, démontrant sa résistance élevée aux

conditions acides (Daeschel et Nes, 1995). Par conséquent, il prédomine souvent dans les aliments fermentés à l’acide lactique spontané où le pH est habituellement inférieur à 4,0. Il survit également dans les conditions acides de l’estomac humain (Johansson et al., 1993). Lb plantarum est presque toujours présent, principalement dans les aliments fermentés à l’acide

Partie Expérimentale Chapitre IV : Résultats et Discussion de l’isolement et l’identification de lactobacilles

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lactique, à base de matières végétales telles que les olives en saumure (Fernández Gonzalez et al., 1993), les câpres (Pulido et al., 2005), la choucroute. (Dedicatoria et al., 1981), cornichons salés (McDonald et al., 1993), levain (Lönner et Ahrné, 1995), et le manioc (Oyewole et

Odunfa, 1990 ; Moorthy et Mathew, 1998). Cela indique que les personnes consommant des

produits fermentés à base d’acide lactique d’origine végétale consomment également de grandes quantités de L. plantarum.

Lactobacillus pentosus est une bactérie lactique également couramment utilisée

comme culture « starter » pour le processus de fermentation (Ruiz-Barba et al., 1994). Certaines souches de L. pentosus exercent des propriétés probiotiques, améliorent l’immunité des muqueuses et créent une résistance aux infections bactériennes (Kotani et al., 2010 ; Izumo et al., 2011).

Dans le but de comparer nos résultats avec ceux trouvés dans d’autres études antérieures et afin de mettre en évidence les liens phylogénétiques entre les différentes communautés bactériennes des miels, une analyse phylogénétique sur la base des séquences du gène ARNr 16S selon la méthode de Neighbor-Joining (Saitou et Nei, 1987) des différents lactobacilles isolés à partir de miels, a été réalisée. Dans cette optique nous avons construit un arbre phylogénétique représentatif du genre lactobacillus par l’utilisation du logiciel Mega 4. (Fig. 85). D’après la figure, l’arbre regroupe trois clades avec des valeurs de bootstrap de 100%, le premier inclut toutes nos souches isolées à partir de miels frais algériens identifiées comme

lactobacillus plantarum et pentosus et sont donc étroitement apparenté, le deuxième clade est

composé de deux sous-branches : lactobacillus sp et lactobacillus Melis forment la première sous-branche avec une valeur de bootstrap de 100%. Ces souches semblent étroitement apparentées. La deuxième est formée par les isolats identifiés comme lactobacillus brevis,

melis, plantarum, pentosus et fermentum avec une valeur bootstrap de 98%. Le troisième groupe

est formé par deux souches de lactobacillus plantarum. D’autres chercheurs ont également étudié la flore lactique dans le miel, (Hasali et al., 2015) et ont signalé la présence de Lb. Brevis dans le miel de mélipionine, tandis qu'Aween et al. (2012) a détecté Lb. acidophilus dans les miels malaisien, libyen et saoudien. Dans des études plus récentes, Bulgasem et al. (2016) ont détecté Lb. plantarum, Pediococcus acidilactici et Pediococcus pentosaceus dans 10 des 15 échantillons de miel. À notre connaissance, aucune information sur les bactéries lactiques provenant de miels algériens n'a été rapportée. La variation de la diversité des espèces du genre

lactobacillus détecté dans les miels peut être due à la diversité des espèces ou races d’abeilles

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est Apis mellifica intermissa que l’on trouve dans le nord du pays et la deuxième est Apis

mellifica sahariensis que l’on trouve dans le sud. D’autre facteurs interviennent également dans

cette variation telle que la source de nectar ou de pollen, la santé et l’âge de l'abeille, la présence d'autres micro-organismes, la saison de récolte (Olofsson et al., 2016). La non détection de certaines espèces peut être due soit à leur absence dans les miels étudiés ou bien à la méthode et les milieux d’isolement utilisés qui n’ont pas permis leur détection.

Partie Expérimentale Chapitre IV : Résultats Et discussions de l’étude des propriétés biologiques

Quantification des composés phénoliques et étude de l’activité antioxydante

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IV.4.1. Quantification des composés phénoliques et étude de l’activité

antioxydante

Durant le processus de respiration cellulaire, les êtres vivants forment des espèces réactives de l’oxygène (ERO). Ces dernières peuvent provenir de plusieurs sources telles que la pollution, la radiation et les rayons ionisants. La production (ERO) est équilibrée par les antioxydants de l’organisme dans les conditions normales (Bouyahya et al., 2017).

L’antioxydant joue un rôle vital dans la détérioration des radicaux libres dans l’organisme et la protection contre la dégradation oxydative. Le manque d’antioxydants dans le corps humain conduit à un phénomène appelé stress oxydatif (Noor et al., 2014). Ce dernier est impliqué dans le développement des maladies cardiovasculaires, neuro-dégénératives de certains cancers et d’autres maladies chroniques telles que le diabète et l’ostéoporose (Massaux, 2014). Plusieurs recherches scientifiques ont démontré l’importance de la consommation régulière des aliments naturellement riches en antioxydants dans la diminution des risques d’apparition de ces maladies

(Massaux, 2014).

Dans le but de valoriser les miels locaux, la quantification de leurs éléments bioactifs (polyphénols totaux et flavonoïdes) ainsi que l’étude de leurs activités antioxydantes ont été réalisé.

Les composés phénoliques sont des métabolites secondaires des plantes. Ces molécules peuvent être divisées en deux groupes, le premier est le groupe des acides phénoliques et les coumarines, le deuxième est celui des flavonoïdes avec les anthocyanes, flavones, flavonones, flavonols (Luchese et al., 2017). Ces dernières années, un intérêt particulier a été porté aux composés phénoliques, en raison des effets bénéfiques de ces derniers sur la santé humaine. Leurs contenus, dans les miels, diffèrent de manière quantitative et qualitative d’un échantillon à un autre (Luchese et al., 2017).

Le dosage des polyphénols totaux (PT) des échantillons a été réalisé en utilisant le réactif de folin -ciocalteu par la méthode colorimétrique de Singleton et al. (1999). Les résultats obtenus sont indiqués en annexe 07 et représentés sur les figures 86, 87, 88 et 89. Les concentrations, calculées à partir d’une courbe étalonnage (Fig. 90), sont exprimées en mg équivalent acide gallique.