Identification et validation des gènes candidats

En étudiant notre série passée en ACPA, nous avons eu comme objectif d'identifier de nouveaux gènes candidats de DI, et pour ce faire, selon le type de CNV, nous avons utilisé

des stratégies différentes. En outre, étant donné la détection des LOH par les puces SNP que nous avons utilisées (cf. 3.2.4.2.3.), nous avons également exploité ce type de données.

2.2.1. Délétions de novo

Un certain nombre de gènes de DI monogénique ont été identifiés en séquençant dans des cohortes de patients à phénotype identique, le ou les gènes retrouvés chez un patient présentant une délétion de novo.

C'est le cas, par exemple du gène CHD7, responsable du syndrome CHARGE : deux délétions

de novo chevauchantes incluant CHD7 ont été retrouvées, en CGH array, chez 2 patients. Et

en effet, un séquençage du gène dans des séries de patients atteints a retrouvé des mutations délétères et permis de valider la responsabilité de ce gène dans le syndrome (Vissers et al. 2004).

C'est aussi de cette façon que le gène MBD5 a été identifié comme responsable de DI, par la détection de délétions de novo en ACPA chez des sujets atteints (Wagenstaller et al. 2007, Talkowski et al. 2011). Notre équipe a également identifié des mutations dans le gène

PCDH19, chez des patientes atteintes d’une encéphalopathie épileptique proche du syndrome

de Dravet, conduisant à une DI de sévérité variable limitée aux filles, après avoir retrouvé une délétion de novo chez un patient qui s’est avéré être mosaïque (Depienne et al. 2009).

Durant notre travail, nous avons détecté plusieurs petites délétions de novo ne contenant qu'un gène (cf. 4.4.1.).

Nous avons utilisé les critères suivants afin de sélectionner les gènes d'intérêt : - le gène est exprimé dans le cerveau ;

- le gène a une fonction parmi celles impliquées dans la DI (cf.1.2.3.) ;

- le gène est d'une taille limitée (permettant ainsi son analyse de façon relativement aisée et peu couteuse) ;

- le phénotype permet d'obtenir facilement une cohorte de réplication via le Centre de référence des déficiences intellectuelles de causes rares, ou via des collaborations extérieures. Lorsque ces critères étaient réunis, nous avons séquencé (en méthode Sanger ou NGS) le gène d'intérêt dans une série de patients possédant le même phénotype que le cas index porteur de la délétion de novo.

2.2.2. Délétions transmises par un parent

Dans cette hypothèse, nous avons sélectionné plusieurs délétions (cf. 4.4.2.), ne contenant qu'un gène nous paraissant intéressant. Les critères que nous avons utilisés pour juger de l'intérêt du gène délété étaient les mêmes que ceux utilisés précédemment pour les délétions

de novo.

.

Lorsque la plupart de ces critères étaient rassemblés nous avons séquencé (en méthode Sanger) le gène d'intérêt sur l'allèle non délété afin de détecter une mutation délétère, qui entraînerait l'expression d'une pathologie AR.

2.2.3. Délétion homozygote

Les délétions homozygotes emportant des séquences codantes sont rares, en dehors des polymorphismes communs. Elles peuvent, quand elles sont présentes, être responsables d'une maladie autosomique récessive (Boone et al. 2013). Ainsi, nous avons suspecté qu'une délétion homozygote des gènes ATAD3B et ATAD3C était pathogène, et réalisé un séquençage d'une série de patients phénotypiquement sélectionnés, à la recherche de mutations homozygotes ou hétérozygotes composites.

2.2.4. Homozygosity mapping

Comme nous l'expliquerons plus loin (cf. 3.2.4.2.3.), l'un des intérêts des puces SNP est la détection des pertes d’hétérozygotie à nombre de copies normal (Copy Neutral Loss of

Heterozygosity ou CNLOH). Pour les cas familiaux de DI autosomique récessive avec

consanguinité, il nous a ainsi été possible d'utiliser ces CNLOH afin de réaliser de "l'homozygosity mapping". Le principe est de sélectionner, dans une famille consanguine, les CNLOH portés par les individus atteints mais absents chez ceux qui ne le sont pas, en émettant l'hypothèse que la mutation homozygote, responsable de la pathologie, est dans une de ces régions (Lander et al. 1987, Hildebrandt et al. 2009, Kaufman et al. 2010). La taille globale des CNLOH d'intérêt est souvent d'autant plus petite qu'il y a d'individus à analyser dans la famille et que la consanguinité est éloignée.

Nous avons ensuite sélectionné les familles pour lesquelles une étude génique a été réalisée selon les critères suivants (cf. 4.4.4.) :

- l'ensemble des CNLOH sélectionnés dans la famille comporte moins de 100 gènes ; - le phénotype permet d'obtenir facilement une cohorte de réplication via le Centre de référence des déficiences intellectuelles de causes rares, ou via des collaborations extérieures. Une fois les CNLOH sélectionnés, si un gène inclus est fortement suspect d'être impliqué dans la DI (d'après la littérature), nous l'avons séquencé selon la méthode Sanger. Dans le cas contraire, nous avons fait réaliser un séquençage de toutes les séquences codantes (l'exome) en NGS, en nous focalisant sur les mutations retrouvées dans les régions sélectionnées par l'homozygosity mapping.

Lorsqu'une mutation potentiellement pathogène a été retrouvée en NGS, nous avons séquencé ce gène en méthode Sanger chez les patients afin de valider le résultat, puis dans une série de patients sélectionnés avec un phénotype comparable.

2.2.5. Points de cassure de remaniements équilibrés

La caractérisation des points de cassure des remaniements équilibrés est une méthode classique d'identification de gènes pathogènes. Cette méthode a par exemple permis d’identifier les gènes NSD1 et NIPBL comme responsables, respectivement, des syndromes de Sotos (Korotaki et al. 2002) et de Cornelia de Lange (Krantz et al. 2004), ou plus récemment, les gènes CDH15 et KIREL3 (Bhalla et al. 2008) comme gènes de DI.

L'ACPA ne nous permet pas de caractériser les points de cassure des remaniements équilibrés car elle ne détecte que les CNV. Nous avons toutefois pu caractériser un remaniement déséquilibré cryptique porté par une patiente DI, dont le père et la soeur non atteints étaient porteurs du remaniement sous sa forme équilibrée avec un point de cassure coupant le gène