a. Création d’une lignée stable exprimant TREK-1 (Article 2)
La recherche d’analogues plus efficaces que la spadine nécessitait d’avoir des outils performants et fiables pour le criblage de ces différentes molécules. Notamment et étant donné que le premier critère de criblage était l’efficacité à bloquer les canaux TREK-1, nous avons établi une lignée stable exprimant ce canal, lignée que nous avons appelée human TREK-1/HEK Cell Line (Figure 1 de l’article).
Bien évidemment, pour que le criblage ait une vraie validité, le canal exprimé par cette lignée devait avoir conservé toutes ses propriétés biophysiques et pharmacologiques. TREK-1 est un canal potassique sensible à différents stimuli. Il est activé par des variations de pression, une acidose intra-cellulaire, des acides gras polyinsaturés (acide arachidonique), mais également par des molécules neuroprotectrices comme le riluzole. En revanche, il est bloqué par la spadine et par les antidépresseurs tels que les SSRIs mais également par les phosphorylations intracellulaires (Honore, 2007).
Nous avons montré que ce canal, exprimé par le clone, conserve les propriétés propres à TREK-1. Il est sensible i) aux pressions négatives : -38 mmHg chez le natif et -35 chez le clone (Figure 2A-B de l’article) ; ii) au pH intracellulaire : une diminution du pH intracellulaire active le canal avec un maximum à pH5,2 (Figure 2E-F de l’article) ; iii) aux acides gras polyinsaturés comme l’acide α-linolénique et l’acide arachidonique (Figure 3A-C) ; iv) au riluzole, comme dans le cas des canaux natifs cet effet est biphasique (Figure 3D-E de l’article) ; v) à la spadine et aux SSRIs (Fluoxétine), comme le canal natif, le canal de la lignée est bloqué avec des affinités équivalentes par la spadine et par des doses thérapeutiques de Fluoxétine (Figure 4 de l’article).
En 2010, l’équipe a démontré que la spadine iodée se fixait sur le canal TREK-1 (Mazella et al., 2010). Pour déterminer la contribution du canal TREK-1 et de la sortiline dans cette liaison nous avons réalisé une expérience de compétition entre la spadine iodée et la spadine « froide » non marquée, sur les cellules entières et sur des homogénats de membrane plasmique de la lignée cellulaire hTREK-1/HEK. Deux sites de liaison ont été mis en évidence, un de faible affinité correspondant très certainement à la sortiline car présent dans les cellules HEK natives, et un de forte affinité correspondant à TREK-1, puisqu’absent sur les cellules natives (Figure 5A-B de l’article). Les cellules HEK expriment de façon constitutive la sortiline, nous avons constaté que l’expression du canal TREK-1 dans ces cellules ne modifie pas l’expression de la sortiline (Figure 1C de l’article). De plus, nous avons confirmé que TREK-1 et la sortiline colocalisent dans les cellules hTREK-1/HEK (Figure 5C).
- 93 - La validité fonctionnelle des canaux TREK-1 exprimés par la lignée stable a été établie dans le protocole d’OGD (Oxygen Glucose Deprivation). Ce protocole est un modèle d’ischémie in vitro qui consiste à priver les cellules d’oxygène (1,2% au lieu de 5%) et de glucose. Dans ce test, si TREK-1 est fonctionnel i) la lignée hTREK-1/HEK doit être mieux protégée que les cellules WT ; ii) l’ajout d’un activateur de TREK-1, comme l’AA, doit accroître la protection ; iii) l’ajout d’un inhibiteur de TREK-1, comme la spadine, doit au contraire reverser la protection. Effectivement, ces trois paramètres ont été observés sur la lignée démontrant la fonctionnalité de TREK-1 (Figure 6 de l’article). De plus, nous avons montré que la transfection de la sortiline augmentait la protection, ceci étant dû au fait que plus il y a de sortiline, plus il y aura de TREK-1 à la membrane et plus la dépolarisation des neurones sera difficile, rendant la protection plus importante et confirmant le rôle de la sortiline comme protéine d’adressage membranaire de TREK-1.
b. Criblage d’analogues de la spadine (Article 3)
La spadine est un peptide dérivé du propeptide lui-même issu de la maturation post- traductionnelle de la sortiline. Comme nous l’avons décrit précédemment, la spadine présente des propriétés antidépressives dans différents tests comportementaux, où elle permet de diminuer la résignation des animaux dans de nombreux tests. De plus, l’administration de spadine pendant seulement 4 jours permet d’augmenter la neurogenèse hippocampique et la transmission sérotoninergique. La spadine est dépourvue d’effets secondaires sur les fonctions contrôlées par le canal TREK-1. Elle n’altère pas les deux courants repolarisants cardiaques, IKr et IKs.
Son délai d’action court ainsi que son absence d’effets secondaires font de ce peptide un candidat de choix pour le développement d’un nouvel antidépresseur. Néanmoins, la spadine a une efficacité in vivo relativement courte, environ 6 heures. Il nous est donc apparu important de rechercher des analogues de la spadine ayant une meilleure biodisponibilité, une affinité accrue pour le canal TREK-1, une stabilité métabolique allongée et par conséquent une activité biologique plus importante. Cette partie de ma thèse a été réalisée en collaboration avec la société MedinCell qui a participé à la recherche d'analogues mais également à la fabrication de formulations avec l'analogue sélectionné. Pour cela nous avons synthétisé des analogues dérivés de la séquence du propetide. Nous avons préparé 12 analogues certains synthétisés en conformation L (énantiomère naturel) et d’autres en configuration rétro-inverso (Figure 1 de l’article).
Afin de comparer leur affinité pour le canal par rapport à la spadine, les analogues ont tous été testés sur l'activité du canal TREK-1, exprimé par la lignée hTREK-1/HEK, à une concentration unique de 100 nM. Cette concentration a été choisie car, dans le cas de la
- 94 - spadine, elle correspond à une inhibition d’environ 70% du courant maximum mesuré après stimulation par l’AA. Ce pourcentage permettait l’identification d’analogues éventuellement plus efficaces que la spadine c’est-à-dire ayant un pourcentage d’inhibition à 100 nM supérieur à 70%. Nous avons ainsi identifié 2 analogues, l’analogue 3 et le 8, qui présentaient une pourcentage d’inhibition supérieur à celui de la spadine (Figure 2b). L'IC50 de chacun a été calculée grâce à une courbe effet-dose, et effectivement ces 2 analogues ont des IC50 inférieures à celle de la spadine (60 nM), IC50 de l’analogue 3 = 11,5 nM et analogue 8 = 9,95 nM (Figure 2c).
L’étape suivante était de tester les propriétés antidépressives de ces deux analogues dans des tests comportementaux. Dans le cas du FST, des traitements aigus ou semi-chroniques par les deux analogues conduisent à une diminution du temps d’immobilité, indiquant un effet antidépresseur des deux molécules (Figure 3a-b de l’article). Cet effet est confirmé par le test de la résignation apprise (Figure 3d-e).
Puisque le but était d’améliorer la durée d’efficacité in vivo de la spadine, nous l’avons mesuré avec le test du FST. Ces deux analogues sont toujours efficaces 16 heures après l’injection alors que la spadine n’est, à ce stade, plus du tout active (Figure 4). Là encore, nous avons amélioré l’effet spadine d’un facteur 3. D’autant plus que ces deux analogues ont conservé leurs effets sur la neurogenèse, effets qui sont équivalents à ceux de la spadine (Figure 5 de l’article).
Ces deux analogues, 3 et 8, ont une affinité sur TREK-1 qui est meilleure d’un facteur 6 et une efficacité relative 18 fois supérieure à celle de la spadine. Le but de notre recherche était en quelque sorte atteint. Toutefois, il nous fallait vérifier que ces analogues n’avaient pas d’effets secondaires au moins sur les fonctions contrôlées par TREK-1, comme la douleur thermique et l’épilepsie. Nous avons ainsi montré que les analogues 3 et 8 n’augmentent ni la sensation de douleur ni le risque d’épilepsie (Figure 6a-b de l’article). Dans le cas de l’épilepsie, des fortes concentrations d’analogues 3 ont un rôle protecteur évident. Ce phénomène, apparemment contradictoire, a déjà été observé avec la spadine. Nous avons également mis en évidence l’absence d’effets des analogues sur les courants cardiaques IKr et IKs (Figure 6c-d de l’article). Enfin, nous avons montré qu’il n’y avait pas d’accoutumance à ces molécules, puisque grâce aux formulations développées par la société MedinCell, nous avons établi que l’analogue 3 reste efficace même après 4 semaines de traitement. L’analogue 3 a été retenu pour plusieurs raisons : son activité est identique à celle de l’analogue 8, mais il est beaucoup plus court et de ce fait il représente le meilleur rapport coût-efficacité. Ce qui est important avec la perspective d’en faire un médicament. D’ailleurs, l’ensemble des résultats obtenus avec les analogues a fait l’objet d’un dépôt de brevet auprès de l’USPTO (United States Patent and Trademark Office).
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c. Article 2
“A human TREK-1/HEK cell line: A highly efficient screening tool for drug
development in neurological diseases”
Hamid Moha ou Maati, Rémi Peyronnet, Christelle Devader, Julie Veyssiere, Fabien Labbal, Carine Gandin, Jean Mazella, Catherine Heurteaux et Marc Borsotto
Plos one
J’ai participé à la réalisation de l’article 2, « A human TREK-1/HEK cell line : a highly efficient screening tool for drug development in neurological diseases”, en réalisant les expériences de RT-PCR et les marquages mettant en évidence la colocalisation des deux protéines.
A Human TREK-1/HEK Cell Line: A Highly Efficient
Screening Tool for Drug Development in Neurological
Diseases
Hamid Moha ou Maati, Re´mi Peyronnet, Christelle Devader, Julie Veyssiere, Fabien Labbal, Carine Gandin, Jean Mazella, Catherine Heurteaux, Marc Borsotto*
Institut de Pharmacologie Mole´culaire et Cellulaire, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, UMR6097), Universite´ de Nice Sophia Antipolis, Valbonne, France
Abstract
TREK-1 potassium channels are involved in a number of physiopathological processes such as neuroprotection, pain and depression. Molecules able to open or to block these channels can be clinically important. Having a cell model for screening such molecules is of particular interest. Here, we describe the development of the first available cell line that constituvely expresses the TREK-1 channel. The TREK-1 channel expressed by the h-TREK-1/HEK cell line has conserved all its modulation properties. It is opened by stretch, pH, polyunsaturated fatty acids and by the neuroprotective molecule, riluzole and it is blocked by spadin or fluoxetine. We also demonstrate that the h-TREK-1/HEK cell line is protected against ischemia by using the oxygen-glucose deprivation model.
Citation: Moha ou Maati H, Peyronnet R, Devader C, Veyssiere J, Labbal F, et al. (2011) A Human TREK-1/HEK Cell Line: A Highly Efficient Screening Tool for Drug Development in Neurological Diseases. PLoS ONE 6(10): e25602. doi:10.1371/journal.pone.0025602
Editor: Sven G. Meuth, University of Muenster, Germany
Received August 10, 2011; Accepted September 6, 2011; Published October 14, 2011
Copyright: ß 2011 Moha ou Maati et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.
Funding: This work is supported by the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), the Agence Nationale de la Recherche -Maladies NeuroPsychiatriques (ANR-2009-MNPS-026.01), and the Fondation Coeur et arte`res. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist. * E-mail: borsotto@ipmc.cnrs.fr
Introduction
Potassium (K+) channels are important in brain and cardiovas- cular diseases both as drug targets and as a cause of underlying pathology. In mammalian excitable cells, their opening results in an inhibitory hyperpolarization, while their closing induces an excitatory depolarization. The therapeutic potential of K+channels as drug targets in medicine is widely recognized, and is an area of active ongoing research. To date, the class III antiarrhythmics, the sulfonylureas used in diabetes mellitus are K+channel inhibitors, and some vasodilators such as nicorandil are K+channel openers. Among the large K+channel class, the most recently identified family, is that of the two-pore-domain K+channels (K2P) with four transmembrane segments and two pore-forming P loops [1]. These channels set the membrane potential towards the K+ equilibrium potential [1,2]. They can be found in excitable or in non-excitable cells. Many K2P are polymodal and respond to a wide range of different regulatory inputs. Rapidly, several K2P channels were identified to be involved in a great diversity of functional roles and responsible for important diseases. TASK-1 (KCNK-3) plays an important role in potassium dependent apoptosis [3] and in central nervous system inflammation [4]. Mutations in the gene of TASK-3 (KCNK9) cause a syndrome of mental retardation [5]. Double TASK-1/TASK-3 deletion in mice also causes primary hyperaldosteronism [6]. TRESK-1 (KCNK18) was recently shown to be involved in pain and migraine [7]. TRAAK (KCNK4) alone or in association with TREK-1 (KCNK2) controls thermal responses of both capsaicin- sensitive and capsaicin-insensitive sensory neurons [8,9].
The TREK-1 channel is the most extensively studied of the K2P channels [1,2]. This stretch activated channel is widely expressed in the brain where it is abundant in regions such as putamen, caudate nucleus, prefrontal cortex, hypothalamus, hippocampus and dorsal raphe, cerebral structures strongly involved in depression [10-12]. TREK-1 is also present in the dorsal root ganglia (DRG) where it is colocalized with transient receptor potential (TRP) channels, that are involved in thermo- sensation [8,9]. The TREK-1 channel is also expressed in peripheral tissues like smooth muscles of the gastrointestinal tract or the prostate [11,12,13]. In the cardiovascular system, expression of this channel has been reported in mesenteric, pulmonary and basilar arteries [14,15] as well as in skin microvessels [16]. In the heart, it has been identified in rat left and right ventricles, atria and septum, and in ventricular myocytes [17,18] but not in the human myocardium. Pharmacologically, TREK-1 is insensitive to all the ‘‘classical’’ K+channel blockers such as 4-AP (4-aminopyridine) or TEA (triethylammonium). Importantly, the complex gating properties of TREK-1 and its modulation by numerous chemical and physical physiological stimuli suits it well to a role in regulating the membrane potential and excitability in various cell types under a range of physiological and pathological situations. This channel is opened by intracellular acidosis, increasing temperatures, phospholipids, the neuroprotec- tive riluzole, volatile and gaseous anesthetics and membrane stretch [19–24]. TREK-1 is blocked by the stimulation of both Gq- and Gs-coupled membrane receptors. Interestingly, antide- pressant selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs) induce a potent inhibition of this channel [25,26]. These particular ways of
TREK-1 modulation together with the generation of knock-out mice for TREK-1 (TREK-12/2) has allowed the demonstration that TREK-1 channels play a key role in the cellular mechanisms of anaesthesia 18, neuroprotection [19,27], pain [8,9] and depression [25,28]. TREK-12/2mice are less sensitive to volatile anesthetic such as chloroform, halothane, isoflurane or desflurane than wild type mice. Gaseous anesthetics such as xenon, nitrous oxide and cyclopropane activate TREK-1 [24]. Polyunsaturated fatty acids (PUFAs) such as Arachidonic acid (AA), alpha-linolenic acid (ALA), docosahexaenoic acid (DHA) or lysophospholipids (LP) such as lysophosphatidylcholine (LPC) also activate TREK-1 channels and are neuroprotective against both ischemia and seizures induced by kainate injections [22,29]. In mice, the deletion of the kcnk2 gene results in an increased sensitivity to both ischemia and epilepsy [22]. TREK-1 channels can be opened by painful stimulations like pressure or heat. TREK-12/2mice are more sensitive than wild type mice to pain induced by heat or mechanical stimuli [8]. TREK-1 channels were reported to be very important in mood regulation. In five behavioral tests TREK- 12/2mice display a depression resistant phenotype [25]. Thus, it has been hypothesized that a TREK-1 blocker could be a potent antidepressant molecule. This hypothesis was validated by the discovery of spadin, that is a sortilin derived peptide and that specifically blocks TREK-1 channels [28,30]. Mice treated with spadin behave similarly to TREK-12/2 or fluoxetine-treated mice. Consequently, TREK-1 channels have become very attractive molecular and pharmacological targets for the develop- ment of new molecules with neuroprotective effects or the design of new drugs for treating pain or mood disorders like depression. Until now, there are no available cell lines to easily screen such molecules. TREK-1 channels have to be transfected into regular cell lines like COS-7, CHO and HEK293. For rapid and efficient screenings, these techniques raise different problems such as the yield of transfection and the level of expression. To avoid these difficulties we developed a HEK293 clone, that we called h- TREK-1/HEK which stably expresses the TREK-1 channel. When compared to the native channel, the TREK-1 channel expressed in the h-TREK-1/HEK clone conserves the sensitivity to its known activators such as stretch, polyunsaturated fatty acids, internal pH decrease and riluzole, and to its blockers such as fluoxetine and spadin. Because hypoxia plays a key role during
ischemia, we highlighted the potent role of the TREK-1 channel in the protection against ischemia in the h-TREK-1/HEK cell line.
Results
h-TREK-1/HEK cell line
A vector expressing h-TREK-1 (pIRES2-eGFP) was transfected into HEK-293 cells in the presence of 1.5 mg/ml Geneticin (G418). After three or four weeks of culture, G418 resistant clones were isolated and reseeded in the same G418 medium (0.5 mg/ mL instead of 1.5 mg/ml). At this stage, all clones were electrophysiologically tested after 48 h of culture and only clones where each single cell expressed the TREK-1 channel were retained (positive clone). Each positive clone was checked after each round of culture. After 14 rounds of culture, we did not observe variations either in the TREK-1 current expression or in the EGFP expression (Figure 1A,B). The TREK-1 channel expression was also measured by q-PCR. Results revealed a large increase in the TREK-1 mRNA expression in the h-TREK-1/ HEK cells (Figure 1C).
To validate the selected clone we studied the modulation of the TREK-1 channel activity by applying variations of membrane stretch or internal pH values, current activators (PUFAs, riluzole) or specific blockers of TREK-1(spadin, fluoxetine). We also confirmed the ability of TREK-1 to bind125I-spadin.
Mechanoactivation
Patches were stimulated with negative pressure pulses, from 0 to 260 mmHg in 210 mmHg increment. No current increases were observed in native HEK cells either in the cell attached (C.A.) (Figure 2A) or in the Inside-Out (I.O.) (Figure 2C) patch configurations. With the h-TREK-1/HEK clone in C.A. mode the current regularly increased with a hyperbolic pattern from 14.561.5 pA to 167.14641.8 pA when the pressure decreased from 0 mm Hg to 260 mm Hg (Figure 2A, B). In the I. O. mode we observed a sigmoı¨dal increase with a plateau value around 250 mm Hg. The maximum current was 542.76161.9 pA at 260 mm Hg (Figure 2C,D). Differences in current values were expected because in the C.A. mode the cytoskeleton induced an inhibitory effect on TREK-1 current. The cytoskeleton effect
Figure 1. GFP expression and functional h-TREK-1 channel activity on h-TREK-1/HEK cells. A) Typical pictures of cells observed in transmission and in fluorescence at round three of cell culture. Functional channel activity was evaluated by current activation with 10 mM AA.B) Typical pictures of cells observed in transmission and in fluorescence at round fourteenth of cell culture. Functional channel activity was evaluated by current activation with 10 mM AA.C) Real time q-PCR. Levels of TREK-1 or sortlin expression were normalized with the cyclophillin D expression. doi:10.1371/journal.pone.0025602.g001
A H-TREK-1/HEK Clone: A Tool for Drug Development
disappeared in the I.O. mode. These differences also explained the differences observed in the current patterns (Figure 2B and Figure 2D).
Sensitivity to internal pH
Lowering the internal pH changes the mechanosensitive TREK-1 channel into a constitutive leak channel [31]. In the I.O. patch configuration from h-TREK-1/HEK clone, the TREK-1 current increased with the acidification from pH 7.2 to pH 5.2. Current values at 0 mV were 81.6618.1 pA, 294.8651.6 pA and 543.26116.7 pA, at pH values of 7.2, 6.2, and 5.2, respectively (Figure 2E,F). At the same pH values, currents of HEK were 12.360.4 pA, 12.860.2 pA and 12.960.3 pA, respectively (Figure 2F). These values were reversible because after a wash with the bath solution the current value returned to the value measured at pH 7.2, 79.2614.4 pA and 11.960.7 pA for h-TREK-1/HEK and HEK, respectively (Figure 2E,F).
All the measurements of the following experiments described below were performed in the presence of a cocktail of potassium channel inhibitors which did not affect TREK-1 channel activity.
Activation of TREK-1 by polyunsaturated fatty acids Polyunsaturated fatty acids (PUFAs) like arachidonic acid (AA), docosahexaenoic acid (DHA) or alpha- linolenic acid (ALA) have the ability to reversibly activate the TREK-1 channel. These effects have been demonstrated to be direct on the channel [32]. Thus, we measured their effects on the TREK-1 channel