Identification de cellules CRIM à partir de marqueurs membranaires

La technique la plus largement utilisée pour isoler ces sous-populations tumorigènes est leur tri sur la base de marqueurs cellulaires identifiés comme marqueurs de cellules souches adultes ou embryonnaires. Les cellules exprimant ces marqueurs sont triées par cytométrie en flux ou colonnes magnétiques. Une fois isolées, ces cellules sont étudiées pour leurs capacités tumorigènes, de différenciation et d’auto-renouvellement. On peut distinguer deux catégories de marqueurs de cellules CRIM :

- les marqueurs issus de l’étude de cellules initiatrices de tumeurs dans d’autres types tumoraux relevant généralement de la voie de différenciation des cellules souches hématopoïétiques.

- Les marqueurs issus de l’étude des voies de différenciation propres aux mélanocytes dont dérivent les mélanomes.

Parmi les marqueurs de la première catégorie, on trouve notamment CD133 (prominin-1), une protéine au rôle inconnu qui interviendrait dans des micro-domaines lipidiques de la membrane plasmique ; CD20 (B lymphocyte antigen), une phosphoprotéine glycosylée présente à la surface de tous les lymphocytes B matures ; et certains transporteurs ABC tels que ABCB1 et ABCG2.

Le marqueur CCD133 avait déjà été identifié dans le cas des glioblastomes. Dans le cas du mélanome, cette protéine a été corrélée à la progression de la maladie puisque son expression est plus importante dans des échantillons de mélanomes que dans les naevi bénins chez des patients (Klein et al. 2007). Son expression dans des échantillons de patients est également retrouvée sur une sous-population représentant moins de 1% de la population tumorale. De plus les cellules CD133+ _{sont plus tumorigènes dans un modèle de souris}

NOD/SCID (Monzani et al. 2007). Des clones sous-exprimant CD133 ont également été développés à partir d'une lignée de mélanome. Ces clones montrent une réduction de la capacité à former des sphères, de la capacité de migration ainsi qu'une perte du pouvoir tumorigène par rapport à des clones contrôles (Rappa et al. 2008a).

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Le marqueur CCD20 (B lymphocyte antigen) est une phosphoprotéine glycosylée présente à la surface de tous les lymphocytes B matures. Sa fonction n’est pas formellement identifiée mais des éléments laissent croire qu’il pourrait s’agir d’un canal calcium. Ce marqueur de différenciation lymphoïde a été retrouvé dans une population de mélanome cultivée dans des conditions non adhérentes. Les cellules CD20 triées ont également été définies plus tumorigènes chez la souris SCID (Fang et al. 2005). Une étude plus récente s’est intéressée à CD20 et a retrouvé ce marqueur sur la grande majorité des échantillons de patients. L’expression de ce marqueur est maintenue par des conditions de culture non adhérentes et ne l’est pas dans des conditions de culture classiques. Des lymphocytes T ciblant spécifiquement CD20 ont ensuite été développés et un traitement par ces cellules entraîne une régression totale et durable de tumeurs de mélanome ne contenant pourtant pas plus de 2% de cellules exprimant CD20 chez la souris (Schmidt et al. 2011).

JARID1B est une histone démethylase très présente dans les tissus en régénération (testicule et moelle osseuse) et qui est impliquée dans le développement des cellules souches somatiques ainsi que des cancers. Dans le cas du mélanome, il a été montré que les cellules exprimant JARID1B définissent une sous-population faiblement proliférante mais capable de donner des progéniteurs rapidement proliférants. Cependant aucune différence de tumorigénicité n'a été visualisée entre les cellules exprimant ou non JARID1B (Roesch et al. 2010).

Les transporteurs ABC seraient impliqués dans le maintien d’un phénotype indifférencié. En effet, le transporteur ABCG2 est sur-exprimé dans les cellules souches hématopoïétiques et embryonnaires (Sarkadi et al. 2010).De plus, sa sur-expression inhibe le développement hématopoïétique normal. De même une sur-expression d’ABCB1 dans des cellules myogéniques C2C12 bloque la différentiation et la formation de myotubes (pour revue, Hadnagy et al. 2006). AABCB1 est exprimé sur une sous-population de culture primaire de mélanomes humains représentant entre 1 et 10% de la population totale. La proportion de cellules exprimant ABCB1 augmente dans des conditions de culture pour cellules souches de façon corrélée à une perte de pigmentation. Les cellules de mélanome ABCB1+ _{triées sont}

plus clonogéniques que les cellules ABCB1- _{et possède une plus grande capacité d'auto-}

renouvellement in vitro (Keshet et al. 2008). Il a également été évoqué qu'AABCG2 puisse être un marqueur de cellules CRIM (Monzani et al. 2007).

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Parmi les marqueurs de la seconde catégorie, on retrouve CD271, un marqueur utilisé pour isoler les cellules souches de la crête neurale ; Nestine, CD34 et le transporteur ABCB5.

Des échantillons de patients ont été analysés puis triés sur la base de l’expression de C

CD271 avant d’être injectés en présence de matrigel dans des souris RG (Rag2-/-_γc-/-₎

(animaux déficients en lymphocytes T et B ainsi qu’en cellules NK). Les cellules exprimant CD271 sont présentes dans 9 tumeurs sur 10 dans des proportions variant entre 2,5 à 40% de la population totale. Elles sont également plus tumorigènes que les cellules n'exprimant pas CD271. De plus, les cellules CD271 reforment in vivo une population hétérogène (Boiko et al. 2010).

La nestine est un filament intermédiaire exprimé dans les cellules souches et progénitrices du système nerveux central. Il a été montré que la nestine est plus exprimée dans les stades tardifs du développement du mélanome mais aucun essai de tumorigénicité n'a été effectué sur les cellules exprimant la nestine (Florenes et al. 1994 ; Klein et al. 2007). Le marqueur CCD34 est présent au niveau des cellules souches adultes de mélanocytes au niveau du renflement du follicule pileux et le marqueur pp75 est considéré comme un marqueur de cellules souches de la crête neurale. Il a été montré dans un modèle de souris nude que les cellules exprimant CD34 étaient plus tumorigènes que les cellules ne l'exprimant pas, cependant, les cellules exprimant p75 sont au contraire moins tumorigènes que les cellules ne l'exprimant pas (Held et al. 2010).

A

ABCB5 a également été étudié en tant que marqueur de cellules CRIM. Ces éléments seront détaillés dans la suite de l'étude.