Identification des différents allèles Efficacité de la transformation bactérienne

Le clonage en vecteur pGEM-T a présenté un taux de réussite final très médiocre. Pour chaque génotype parental, 16 colonies transformées ont été sélectionnées. Une PCR de contrôle pour chaque colonie a permis d’identifier 22 colonies (4 pour P. davidiana, 5 pour

SG et SD40 et 8 pour Zephir) possédant l’insert du fragment d’intérêt FRK-b de 1500 pb. Ces 22 colonies ont été envoyées à séquencer et 18 d’entre elles se sont révélées exploitables (faux positifs et échec de séquençage pour les 4 autres). Le séquençage de ces colonies a été réalisé dans les deux sens (Forward et Reverse) de manière à obtenir la séquence complète du gène candidat FRK-b.

Isolation des allèles

Le but de ce clonage est d’isoler les deux allèles des parents afin de pouvoir repérer dans la population BC2 la provenance des allèles de chaque individu. L’individu SD40, étant un hybride de première génération entre P. davidiana et Summergrand, a hérité d’un allèle de

chacun des deux parents. En comparant les séquences nucléotidiques de SD40 avec celles de ses parents, il nous a été possible d’identifier chez SD40 l’allèle provenant de P. Davidiana et celui provenant de Summergrand. Ceci nous a ensuite permis d’identifier le

second allèle de P. Davidiana (bien que son intérêt soit très limité par le fait qu’il ne soit pas

passé dans la descendance) et le second allèle de Summergrand qui lui est présent dans la descendance du fait du premier backcross (croisement de SD40 et Summergrand). Par ailleurs, nous avons pu différencier les deux allèles du parent Zéphir, dont un est identique à

SG_SD40_Ze 901 GAACAAATAACTCAAATCCACTTTCCAATTTCATTTGTTATTTTGAAAAGGTTGTGTTGT

D-SD40 900 GAACAAATAACTCAAATCCACTTTCCAATTTCATTTGTTATTTTGAAAAGGTTCTGTTGT

SG_SD40_Ze 961 TATTTTCTTTTTTTTAATATTCAAATCATTAGATCACGATATGATTCCTTTGAGATCAAG

D-SD40 960 TATTTTCTTTTTTTTAATATTCAAATCAATAGATCACGATATGATTCCTGTGATATCAAG

SG_SD40_Ze 1021 ATATATTAAGATATGGGTCCCACTAATGGAAAAAAGAAGAAGAGAATACTGAGATATGGG D-SD40 1020 ATATATTAAGATATGGGTCCCACTAATGGAAAAAAGAAGAAGAGAATACTGAGATATGGG SG_SD40_Ze 1081 TCCCACTAATCCAACTTCCTTTGTCCACAAACCGAAATCATGAGAATGACCTAACACTAC D-SD40 1080 TCCCACTAATCCAACTTCCTTTGTCCACAAACCGAAATCATGAGAATGACCTAACACTAC SG_SD40_Ze 1141 CTAACCCCAATTGCCCAAAGCAACAAAAAGTCAGAATTAATTATACAACTATGCAAATAT D-SD40 1140 CTAACCCCAATTGCCCAAAGCAACAAAAAGTCAGAATTAATTATACAACTATGCAAATGT

SG_SD40_Ze 1201 AGCTTAGGTGAGTTGGTTAAAGCA---CACTCAAGTTAGATTATACA

D-SD40 1200 AGCTTAGGTGAGTTGGTTAATGCAGTGTGCGGCGCAGTTACACTCAAGTTAGATTATACA

SG_SD40_Ze 1245 ACAATGCAAGTGCAAGAAACAGTATTGTATTGTATT---GGATGAGATGAAC

D-SD40 1260 ACAATGCAAGTGCAAGAAACAGTATTGTATTGTATTTGTATTGTATTGGATGAGATGAAC

Figure 18 : Alignement des séquences de FRK-b sur la zone 900-1293 (allèle commun à Summergrand (SG), SD40 et Zéphir (Ze) et allèle commun à P. davidiana (D) et SD40)

Figure 19 : Alignement de la FRK-b de référence (FRK-AJ873070) avec les fructokinases homologues d'autres espèces végétales

FRK_ AJ873070 1 SIWEKADLIKISDVELEFLTGNPKIDDENALTLWKDNLKLLLVTLGENGCRYYTKHFRGS

D-1_SD40-1 1 -IWEKADLIKISDVELEFLTGNPKIDDENALTLWKDNLKLLLVTLGENGCRYYTKHFRGS

SG-1_SD40-2_Ze-1 1 SIWEKADLIKISDVELEFLTGNPKIDDENALTLWKDNLKLLLVTLGENGCRYYTKHFRGS

Ze-2 1 SIWEKADLIKISDVELEFLTGNPKIDDENALTLWKDNLKLLLVTLGENGCRYYTKHFRGS

FRK_ AJ873070 61 VEAFHVKTVDTTGAGDSFVGALLAKIVDDHLFLKDEQRLRGVLKFANACGAITTTKKGAI D-1_SD40-1 60 VEAFHVKTVDTTGAGDSFVGALLAKIVDDQSILEG--- SG-1_SD40-2_Ze-1 61 VEAFHVKTVDTTGAGDSFVGALLAKIVDDQSILEG--- Ze-2 61 VEAFHVKTVDTTGAGDSFVGALLAKIVDDQSILEG--- FRK_ AJ873070 121 PALPSESEAFTLIKGA D-1_SD40-1 --- SG-1_SD40-2_Ze-1 --- Ze-2 ---

Figure 20 : Alignement des séquences protéiques des différents allèles de la FRK-b ((allèle commun à Summergrand (SG), SD40 et Zéphir (Ze) et allèle commun à P. davidiana (D) et SD40 et second allèle de Ze)

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celui de Summergrand présent chez l’individu SD40. Ainsi, il sera possible d’étudier la répartition des différents allèles parentaux dans la population BC2 de manière à déterminer ensuite s’il existe un lien entre le génotype à ce locus et le déficit en fructose.

Notons que les séquences présentent un taux de polymorphisme très élevé. En effet, chez un même génotype, où nous devrions retrouver seulement deux séquences différentes, un nombre important de substitutions est détecté. Ce fort taux de polymorphisme (1 toutes les 100 à 200 pb) ne peut pas être imputé à d’éventuelles erreurs de la Taq polymerase utilisée au laboratoire. L’hypothèse la plus probable serait que les amorces utilisées ne soient pas très spécifiques de FRK-b et amplifient d’autres copies de ce gène, membre d’une famille polygénique dont nous ignorons la taille. La faible température d’hybridation (53°C) pouvant aussi augmenter les erreurs.

Etude protéique

Une fois les allèles identifiés et leurs séquences consensus définies, nous avons étudié l’impact des mutations ponctuelles relevées entre les différents allèles (Figure 18). Pour ce faire, nous avons tout d’abord procédé à l’identification des séquences codantes et non codantes par comparaison avec la séquence de référence, extraite des bases de données et qui avait servie de matrice lors du design des amorces. Cette séquence étant un EST, elle ne correspond qu’à la partie codante de la séquence (puisqu’obtenue par transcription inverse d’un ARNm). Une fois les séquences exoniques définies, nous les avons traduites en protéine à l’aide de l’interface BCM et comparées à l’aide d’outils d’alignement multiple de séquences.

Les mutations ponctuelles relevées le long de la séquence allélique sont soit silencieuses, c’est à dire qu’elles ne provoquent pas de changement d’acide aminé au niveau protéique, soit situées dans des zones introniques éliminées lors de l’épissage au moment de la transcription en ARNm, avant la traduction en protéine.

Il est cependant essentiel de noter que la séquence de fructokinase obtenue ne correspond qu’à une séquence partielle. En effet, l’alignement de cet EST avec les séquences connues d’autres espèces végétales comme la vigne (Vitis vinifera), la tomate (Solanum esculentum),

le peuplier (Populus trichocarpa) et Arabidopsis thaliana, révèle que cette séquence ne

correspond qu’à la partie centrale de la séquence des autres fructokinases (Figure 19). Notons aussi que la séquence présente une homologie très nette avec les fructokinases de type 2 des autres espèces végétales.

Ainsi, bien qu’il n’y ait pas de différence entre les séquences protéiques des différents allèles (Figure 20), ces séquences ne couvre pas l’intégralité de la séquence de ce que nous pouvons désormais appeler la « fructokinase 2 » du pêcher. Il est tout à fait possible que des mutations dans les zones non clonées soient responsables de modifications qui se répercutent au niveau protéique par une non fonctionnalité d’un site actif de la protéine.

Pour vérifier cela, il faudrait réussir à synthétiser des amorces spécifiques du début de séquence à partir des fructokinases 2 complètes des espèces proches du pêcher.

Parmi les 5 candidats assimilés à la fructokinase, la FRK-b a pu être cartographiée à environ 15 cM du locus du QTL-gène majeur du caractère « sans-fructose ». Cette FRK-b, dont la séquence n’est que partielle, peut être assimilée par homologie à une fructokinase de type 2. Les différences au niveau nucléotidique des allèles parentaux partiellement identifiés n’engendrent pas de changement au niveau de la fonctionnalité de la protéine. De manière à élucider l’implication de la FRK-b dans le caractère « sans-fructose », des mesures d’expression et d’activité de l’enzyme sont à envisager.

PGI_ref 1 QGTRSALYGNDRESITVTVQEVTPRSVGALIALYERAVGIYASLVNINAYHQPGVEAGKK SG-1 1 QGTRSALYGNDRESITVTVQEVTPRSVGALIALYERAVGIYASLVNINAYHQPGVEAGKK SD40-1 1 QGTRSALYGNDRESITVTVQEVTPRSVGALIALYERAVGLYASLVNINAYHQPGVEAGKK SG-2 1 QGTRSALYGNDRESITVTVQEVIPRSVGALIALYERAVGIYASLVNINAYHQPGVEAGKK D-1 1 ---GVEAGKK D-2 1 ---GVEAGKK Ze-2 1 ---GVEAGKK PGI_ref 61 AAGEVLALQKRVLAVLNEASCKEPVEPLTLEEVADRCHSPEQIEMIYKIIAHMAANDRAL SG-1 61 AAGEVLALQKRVLAVLNEA--- SD40-1 61 AAGEVLALQKRVLAVLNEA--- SG-2 61 AAGEVLALQKRVLAVLNEA--- D-1 8 AAGEVLALQKRVLAVLNEASCKEPVEPLTLEEVADRCHSPEQIEMIYKIIAHMAANDRAL D-2 8 AAGEVLALQKRVLAVLNEASCKEPVEPLTLEEVADRCHSPEQIEMIYKIIAHMAANDRAL

Ze-2 8 AAGEVLALQKRVLAVLNEASCKEPVVPLTLEEVADRCHSPEQIEMIYKIIAHMAANDRAL

PGI_ref 121 IAEGSCGSPRSIKVFLGECNV SG-1 --- SD40-1 --- SG-2 --- D-1 68 IAEGSCGSPRSIKVFLGECNV D-2 68 IAEGSCGSPRSIKVFLGECNV Ze-2 68 IAEGSCGSPRSIKVFLGECNV

Figure 21 : Alignement des séquences protéiques des différents allèles de la PGI-b avec la PGI de référence (PGI-ref)

Figure 22 : Alignement de la PGI de référence avec les PGI homologues d'autres espèces végétales.

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