Cartographie des gènes candidats

Dans un premier temps, et pour les 6 séquences extraites des bases de données, nous avons tenté la recherche d’un polymorphisme de longueur pour cartographier les candidats non localisés (SDH-b à f) et vérifier la localisation du candidat SDH-a localisé sur le groupe de liaison 2 dans le projet Isafruit, mais dont nous souhaitons élucider l’implication dans les variations de teneurs en fructose. Les résultats de la détection de polymorphisme de longueur par PCR simple et révélation en gel d’agarose sont décrits dans le tableau 10.

Les 3 séries d’amorces dessinées à partir du candidat SDH-a, n’ont permis de révéler aucun polymorphisme de longueur entre les différents génotypes que nous avons testés.

Pour les 5 autres séquences, EST isolés annotés SDH, extraits des bases de données, 3 séquences (SDH-c, d et e) ne présentent aucun polymorphisme de longueur entre nos génotypes d’intérêt, ce qui ne permet pas de les cartographier directement. Quant aux 2 séquences restantes (SDH-b et f), les profils obtenus sont de type multi-bandes parmi lesquelles nous n’avons pas pu identifier la séquence d’intérêt. En effet, les séquences sont dérivées d’ESTs qui par définition ne sont constitués que d’une séquence codante: la taille des séquences amplifiées pourra donc être supérieure à la taille attendue, de part la présence d’introns sur la séquence cible..

Un clonage du candidat SDH-e en vecteur pGEM-T a été réalisé. Cependant, le faible taux de réussite et la forte quantité de faux-positifs obtenus ne nous ont pas permis d’étudier plus précisément ce candidat.

0 0,5 1 1,5 2 2,5 SG D C203 C227 C216 C207 E x p re s s s io n r e la ti v e

Figure 14 : Expression relative du gène SDH-a chez Summergrand (SG), P. davidiana (D), C203, C227, C216 et C207, C207 étant pris comme référence

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IV.3.2.Expression de gène

IV.3.2.1. Rendement des extractions ARN

Les rendements des deux séries d’extraction d’ARN réalisées à partir de fruits des génotypes d’intérêt sont présentés dans le tableau 11.

Nous pouvons remarquer que le rendement de la seconde série d’extraction est supérieur à la première série, avec une moyenne de 343.16 ng.g^-1 MF contre 261.92 ng.g^-1 MF. Cette différence peut être attribuée au fait que la seconde extraction a été réalisée à partir de poudre de fruits verts donc plus riches en ARN que les fruits mûrs. En effet, la quantité d’ARN contenue dans le fruit diminue considérablement après la maturation du fruit, le fruit mûr entrant dans une phase de sénescence et donc de dégradation de ses composants. La comparaison des quantités de transcrits présentes aux différents stades de développement du fruit ne sera pas étudiée par la suite.

IV.3.2.2. Mesure de l’expression des gènes

Afin d’étudier l’accumulation dans la chair des fruits des transcrits (ARNm) de la SDH-a, caractérisée par Yamada (2001), des PCR quantitatives en temps réel ont été réalisées pour chacun des individus d’intérêt choisit pour représenter la population entière : C203 et C227, génotypes « avec fructose » et C207, C216, génotypes « sans fructose » ainsi que les parents P. Davidiana et Summergrand.

Résultats préalablement obtenus par µPEACH 1.0

Une puce à ADN est un ensemble de molécules d'ADN fixées (sondes) de façon ordonnées sur une petite surface. Cette biotechnologie récente permet d'analyser le niveau d'expression des gènes (transcrits) dans une cellule, un tissu, un organe, un organisme ou encore un mélange complexe, à un moment donné et dans un état donné par rapport à un échantillon de référence.

Le principe de la puce à ADN se base sur l’hybridation spécifique des ADN complémentaires, issus d’un organe à un moment donné, dans un état physiologique donné, avec une sonde correspondant à un gène connu.

Cette analyse réalisée en 2007, à partir d’ARN extraits de 2 des génotypes d’intérêt, C203 et C216, a révélé un différentiel d’expression entre ces deux individus. Le gène de la SDH-a est surexprimé chez C216, génotype présentant un phénotype « sans fructose » par rapport à C203. Le génotype C203 présentait un niveau d’expression relative de -1.19, c'est-à-dire près de 12 fois inférieur à C216 (pris comme référence).

Mesure de l’expression relative par qPCR

Les mesures des niveaux d’expression relative de la SDH dans la chair des fruits de chacun des individus d’intérêt donnent les résultats suivants (Figure 14).

Il apparait clairement que les génotypes C207 et C216 présentent des niveaux d’expression très nettement supérieurs aux autres génotypes. Les génotypes P. Davidiana,

Summergrand, C203 et C227 montrent des niveaux d’expressions au minimum 2 fois inférieurs à celui de C207, pris comme référence. Les génotypes C207 et C216 présentant tous les deux un phénotype déficitaire en fructose, nous pouvons en déduire que les individus « sans fructose » présentent une surexpression du gène de la SDH.

Par ailleurs, il est intéressant de noter qu’aucun des deux parents P. Davidiana et

Summergrand, ne présente des niveaux d’expression comparables à ceux relevés chez leurs descendants « sans fructose », mais qu’au contraire les niveaux d’expression de la SDH chez les parents et les descendants « avec fructose » sont proches.

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 C203 C227 C216 C207 A c ti v it é r e la ti v e

Figure 15 : Activité relative de la SDH chez les individus C203, C227, C216 et C207, C207 étant pris comme référence

Figure 16 : Polymorphisme de longueur mis en évidence pour la FRK-b entre P. davidiana (D) d’une part et et Summergrand (SG) et Zéphir (ZE) d’autre part

D S^D 4 0 S G C 2 0 3 Z E C 2 2 7 C 2 1 6 C 2 0 7

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Les individus ‘sans fructose’ présentent donc une surexpression de la SDH-a, ce qui corrobore les résultats obtenus par analyse avec la puce à ADN µPEACH 1.0.

Ce résultat est quelque peu surprenant du fait que la SDH est l’enzyme catalysant la formation de fructose à partir du sorbitol. Une surexpression de celle-ci tendrait plutôt à augmenter le contenu en fructose du fruit. Deux hypothèses majeures peuvent expliquer ces résultats : la protéine n’est pas fonctionnelle chez les ‘sans fructose’ ou le phénotype ‘sans fructose’ est dû à un autre gène intervenant ailleurs dans le métabolisme du fructose. Dans les deux cas, une teneur en fructose anormalement basse pourrait provoquer la surexpression du gène de la SDH pour tenter de rétablir l’équilibre fructose/glucose. Dans le premier cas, c’est une surexpression sans conséquence puisque l’enzyme est non fonctionnelle. Dans le second cas, la surexpression ne parvient pas à rétablir une teneur normale en fructose qui est par ailleurs trop réduite. La quantité de fructose contrôlerait de façon rétroactive la synthèse de SDH.