Hydrolyse enzymatique de l’amidon

Dans l’industrie agroalimentaire et notamment dans les glucoseries, l’amidon est utilisé comme substrat initial pour produire du maltose ou du glucose qui servira à la production de sirop de fructose ou de sucre cristallisé. Pour cela, différentes enzymes sont nécessaires avec différentes spécificités :

 des enzymes de dégrossissement hydrolysant les liaisons α-(1,4) de manière aléatoire, telles que les α-amylases,

 _{des enzymes de débranchement hydrolysant les liaisons α-(1,6), telles que les pullulanases} et les isoamylases,

 des enzymes de finition hydrolysant les liaisons α-(1,4) par les extrémités non réductrices, telles que les amyloglucosidases.

a. Les α-amylases et les β-amylases

Les amylases sont un groupe d’enzymes qui, par leur action conjointe, permettent de réduire la taille des chaînes d’amidon. C’est pourquoi elles sont souvent utilisées dans les étapes de liquéfaction et de saccharification de l’amidon (processus permettant de transformer des sucres complexes en sucres simples). Les plus utilisées sont les α-amylases et les β-amylases.

Les α-amylases ou endo-amylases (EC. 3.2.1.1) sont des enzymes qui catalysent l’hydrolyse des liaisons glucosidique α-(1,4) de manière aléatoire en milieu de chaîne. Cette hydrolyse conduit à la production de dextrines (polyosides contenant des liaisons glucosidiques α-(1,6)) contenant trois ou plus unités de glucose suivant le site de coupure (Figure 36). Le pH et la température optimum dépendent de la source de l’enzyme : pour les α-amylases d’origine humaine, le pH et la température optimum sont respectivement de 7 et 37-40°C, pour les α-amylases d’origine bactérienne ou végétale, ils sont de 4-5 et de 50-60°C¹⁹⁵. Les α-amylases sont des métalloenzymes à calcium composées d’environ 520 acides aminés pour un poids moléculaire d’environ 60 kDa. Elles contiennent 3 domaines nommés A, B et C. Le calcium est situé entre les domaines A et B et agit en tant que stabilisateur de la structure. Le site actif de l’enzyme, correspondant au site de liaison du substrat et donc de l’amidon, se situe entre les domaines A et B¹⁹⁶.

Figure 36 : Représentation schématique de l’action de l’α-amylase sur l’amidon.

Les β-amylases ou exo-amylases (EC 3.2.1.2) sont des enzymes retrouvées dans les graines en germination et les bactéries. Le pH optimal de ces enzymes est compris entre 5 et 6 pour les enzymes d’origine végétale et entre 6 et 7 pour les enzymes d’origine bactérienne, et la température optimale est comprise entre 40 et 55°C. De même que pour l’α-amylase, la β-amylase est une métalloenzyme à calcium de 520 acides aminés environ pour un poids moléculaire d’approximativement 60 kDa. Elle

contient également trois domaines nommés A, B et C. Le site catalytique se situe au centre de l’enzyme, au niveau du domaine A¹⁹⁷. Les β-amylases catalysent l’hydrolyse des liaisons glycosidique α-(1,4) successivement à partir des extrémités non réductrices de l’amidon, libérant une unité de maltose (correspondant à un diose) (Figure 37). Cette hydrolyse conduit à un mélange de maltose et de dextrines résiduelles, correspondant aux zones de ramification. En effet, l’enzyme s’arrête de fonctionner 3 à 4 résidus avant la zone de branchement car elle n’a pas la capacité d’hydrolyser les liaisons glucosidiques α-(1,6). Elles ne peuvent donc qu’hydrolyser les chaînes d’amylose. Au cours de l’hydrolyse, il y a inversion de la position de la fonction hémiacétalique libérée et l’anomère β du maltose est alors libéré.

Figure 37 : Représentation schématique de l’action de la β-amylase sur l’amidon.

Ces enzymes permettent la réduction de la taille de l’amidon mais il subsiste, dans le mélange final des produits non hydrolysés tels que des dextrines résiduelles contenant des liaisons glucosidiques α-(1,6).

b. Les isoamylases et les pullulanases

L’amidon contient de l’amylopectine caractérisée par des liaisons glucosidiques α-(1,4) et α-(1,6). Pour avoir une hydrolyse complète de l’amidon, il est nécessaire d’hydrolyser ces liaisons glucosidiques α-(1,6). Des enzymes de débranchement, telles que les isoamylases et les pullulanases sont donc utilisées.

Les isoamylases (EC. 3.2.1.68) sont des enzymes produites chez un grand nombre de micro-organismes. Le pH optimal de ces enzymes se situe vers 5, et la température optimale est comprise entre 40 et 60°C. Les isoamylases sont des métalloenzyme à calcium d’environ 570 acides aminés et de poids moléculaire d’environ 80 kDa. Elles contiennent trois domaines nommés N, A et C. Le domaine A peut être divisé, comme chez les α-amylases et les β-amylases, en domaines A et B. Le site catalytique se situe au centre du domaine A au niveau des acides aminés Asp375, Glu435 et Asp510¹⁹⁸. Les isoamylases catalysent l’hydrolyse des liaisons glycosidiques α-(1,6), permettant la réduction de la chaîne d’amylopectine et de certaines dextrines conduisant à la formation d’un mélange ne contenant que des chaînes linéaires de polysaccharides (Figure 38).

Figure 38 : Représentation schématique de l’action de l’isoamylase et de la pullulanase sur l’amidon.

Les pullulanases (EC. 3.2.1.41) sont, comme les isoamylases, des enzymes capables d’hydrolyser des liaisons glucosidiques α-(1,6), permettant le débranchement de structures telles que l’amylopectine, comme les isoamylases (Figure 38). Les pullulanases sont produites puis extraites de chez de nombreux micro-organismes. Le pH et la température optimum sont respectivement compris entre 7 et 9 et entre 45 et 60°C. La pullulanase est formée d’environ 1100 acides aminés. De même que pour l’isoamylase, la pullulanase contient 3 domaines : les domaines N, A et C. Elle contient jusqu’à cinq ions calcium. Le domaine catalytique se situe au niveau des trois ions calcium dans le domaine A¹⁹⁹.

Ces différentes enzymes permettent la production de maltoses ou de dextrines mais, malgré une action commune de ces enzymes, la production de glucose serait aléatoire et ne serait possible que

par les α-amylases. Cependant, dans l’industrie du glucose, il est nécessaire d’hydrolyser de l’amidon conduisant à une production efficace de glucose.

c. Les amyloglucosidases

Les amyloglucosidases (AMG) (EC. 3.2.1.3) sont des enzymes produites chez de nombreux micro-organismes et notamment les champignons. L’AMG extraite d’Aspergillus niger, est une enzyme d’environ 620 acides aminés pour un poids moléculaire de 97 kDa. La structure tridimensionnelle de l’AMG présente trois domaines : le domaine N-terminal et le domaine C-terminal liés par un troisième domaine. Le domaine catalytique de l’AMG se situe au niveau de la région N-terminale et contient de nombreuses hélices. Le site de liaison de l’amidon se situe quant à lui au niveau de la région C-terminale et contient de nombreux feuillets (Figure 39). Deux isoformes de l’AMG existent : G1 et G2. L’isoforme G1 se différencie de G2 par la présence du site de liaison à l’amidon, site absent sur G2 ^200,201.

Figure 39 : Structure tridimensionnelle de l’AMG : (A) le domaine catalytique du résidu 30 (bleu) au résidu 487 (rouge) contenant des hélices représentées par des cylindres²⁰⁰ et (B) le domaine de liaison de l’amidon du résidu 509 (bleu) au résidu 616 (rouge) contenant de nombreux feuillets représentés par des flèches²⁰¹.

L’AMG est une exo-amylase qui catalyse l’hydrolyse des liaisons glucosidiques α-(1,4) successivement à partir des extrémités non réductrices de l’amidon, libérant une unité de glucose. Cependant, il a été montré que l’AMG avait également une activité d’hydrolyse sur les liaisons glucosidiques α-(1,6), permettant le débranchement de l’amylopectine présente dans l’amidon (Figure 40). L’activité sur les liaisons α-(1,6) est très faible comparée à celle sur les liaisons α-(1,4) et ne représente que 0,2% de cette activité. L’AMG a un pic d’activité pour un pH compris entre 3,5 et 5 et une température comprise entre 50 et 60°C^202,203. La propriété de double hydrolyse de l’AMG sur

les liaisons glucosidiques α-(1,4) et α-(1,6) en fait une enzyme de choix pour la production de glucose à partir d’amidon.

Figure 40 : Représentation schématique de l’action de l’amyloglucosidase sur l’amidon.

De nombreuses enzymes peuvent être utilisées pour hydrolyser les liaisons glucosidiques α-(1,4) et α-(1,6) de l’amidon. Ces enzymes possèdent des mécanismes d’actions différents et sont très largement utilisées pour la conversion enzymatique de l’amidon dans l’industrie du glucose puisqu’elles permettent d’obtenir des dextrines de taille variable et du glucose. Cependant, une seule de ces enzymes est capable de produire spécifiquement du glucose : l’amyloglucosidase par hydrolyse spécifique des liaisons glucosidiques α-(1,4) par les extrémités non réductrice de l’amidon.