Etude du comportement des nanoparticules contenues dans des hydrogels

Dans le cadre du projet de recherche ANR, les nanoparticules sont utilisées au sein d’un hydrogel de fibrine enrichi en amidon et doivent permettre la production et la libération de glucose afin

d’améliorer la survie des hCSMs. Pour cela, l’étude de la stabilité des NPe au sein d’hydrogels a été effectuée sur des hydrogels de fibrine (18 mg/mL) et des hydrogels de fibrine-amidon 2% (m/v) contenant des NPe à 2 mg/mL sur 14 jours. Ce temps correspond à celui qui a été utilisé pour effectuer la preuve de concept de la biofonctionnalité du biomatériau in vitro et in vivo.

a. Suivi de l’organisation des nanoparticules au sein d’hydrogels

La répartition des nanoparticules au sein des hydrogels a été observée grâce à l’utilisation des NP et des NPe dont la coque a été marquée par du 9,10-diphénylanthracène (NP^diϕ et NPe^diϕ) comme décrit précédemment. Le réseau protéique de fibrine a été marqué post-synthèse à l’AlexaFluor568 comme décrit précédemment et les hydrogels ont ensuite été observés en microscopie confocale.

La stabilité du réseau de fibrine dans les hydrogels de fibrine et fibrine-amidon a tout d’abord été étudiée (Figure 70).

Figure 70 : Stabilité des hydrogels de fibrine et fibrine-amidon observée en microscopie confocale. Les

hydrogels de fibrine (18 mg/mL) et fibrine-amidon 2% (m/v) ont été marqués à l’AlexaFluor568 post-synthèse puis observés au microscope confocal à différents temps avec un grossissement de x400. Le laser utilisé est un laser DPSS à 561 nm, la barre d’échelle est de 50 µm.

Comme observé précédemment, l’hydrogel de fibrine est composé d’un réseau régulier de fibres denses et homogènes. L’ajout d’amidon dans la formulation du matériau induit une hétérogénéité et l’apparition de blocs non protéiques répartis de manière hétérogène dans le réseau. Néanmoins après 7 ou 14 jours d’incubation en tampon Hepes contenant 150 mM de NaCl et 20 mM de CaCl2

(tampon Hepes et sels), la structure de ces réseaux reste identique, indiquant que ces réseaux ainsi que le marquage fluorescent sont stables au cours du temps.

La stabilité des nanoparticules au sein des hydrogels a ensuite été étudiée, en commençant par l’hydrogel de fibrine (Figure 71).

Figure 71 : Stabilité des nanoparticules au sein de l’hydrogel de fibrine observée en microscopie confocale.

Les hydrogels de fibrine (18 mg/mL) contenant des NP^diϕ et des NPe^diϕ à 2 mg/mL ont été marqués post-synthèse à l’AlexaFluor568 puis observés au microscope confocal à différents temps avec un grossissement de x400. Pour le marquage à l’AlexaFluor568, le laser utilisé est un laser DPSS à 561 nm, pour les NP^diϕ et les NPe^diϕ, une diode à 405 nm a été utilisée. La barre d’échelle est de 50 µm.

Ces résultats montrent qu’à J1, les nanoparticules (NP^diϕ et NPe^diϕ) forment une population monodisperse et sont réparties de manière homogène au sein de l’hydrogel. A partir de 7 jours d’incubation à 37°C, des agrégats de nanoparticules de quelques micromètres apparaissent au sein du réseau de fibrine, comme observé précédemment lors de l’étude de la stabilité des nanoparticules en solution. Cependant, la taille des agrégats n’augmente pas à J14 contrairement à

ce qui a été observé lors de l’étude en solution. L’hydrogel de fibrine, pourrait donc servir de barrière physique entre les nanoparticules/agrégats et ainsi éviter d’augmenter l’agrégation des nanoparticules au cours du temps. Cette analyse est valable aussi bien pour les NP^diϕ que pour les NPe^diϕ, indiquant que l’encapsulation de l’AMG dans des nanoparticules de PLGA ne modifie pas leur comportement au sein d’un hydrogel de fibrine.

La répartition des NP^diϕ et des NPe^diϕ a ensuite été étudiée au sein de l’hydrogel de fibrine-amidon (Figure 72).

Figure 72 : Stabilité des nanoparticules au sein de l’hydrogel de fibrine-amidon observée en microscopie confocale. Les hydrogels de fibrine-amidon (respectivement 18 mg/mL et 2% (m/v)) contenant des NP^diϕ et des NPe^diϕ à 2 mg/mL ont été marqués post-synthèse à l’AlexaFluor568 puis observés au microscope confocal à différents temps avec un grossissement de x400. Pour le marquage à l’AlexaFluor568, le laser utilisé est un laser DPSS à 561 nm, pour les NP^diϕ et NPe^diϕ, une diode à 405 nm a été utilisée. La barre d’échelle est de 50 µm.

Les observations de microscopie confocale indiquent qu’à J1, les nanoparticules (NP^diϕ et NPe^diϕ) sont réparties de façon homogène au sein de l’hydrogel de fibrine-amidon, aussi bien dans le réseau de fibrine que dans les amas d’amidon. Après 7 jours d’incubation, des agrégats de quelques micromètres sont observés et la taille de ses agrégats n’augmente pas à J14, comme observé dans un hydrogel de fibrine. La présence d’amidon dans la formulation de l’hydrogel ne semble donc pas

modifier le profil d’agrégation des nanoparticules au cours du temps. Il est important de noter que la microscopie confocale ne permet pas une analyse fine de la taille des agrégats.

Ces résultats obtenus semblent être identiques pour les NP^diϕ et les NPe^diϕ démontrant que l’encapsulation de l’AMG ne semblerait pas affecter l’agrégation de ces nanoparticules. Pourtant l’AMG devrait permettre l’hydrolyse de l’amidon pouvant conduire à une modification de la structure interne de l’hydrogel après quelques jours. Cette hydrolyse permettrait alors l’obtention d’un réseau plus lâche et une plus grande possibilité de diffusion des agrégats dans l’hydrogel. Ces résultats pourraient peut-être s’expliquer par une faible hydrolyse de l’amidon présent au sein de l’hydrogel après 14 jours d’incubation.

b. Suivi de la morphologie des nanoparticules contenues dans des

hydrogels

L’étude morphologique des nanoparticules effectuée en solution a permis de mettre en évidence une évolution progressive d’une forme sphérique vers une forme allongée. Il est donc intéressant de déterminer si ce changement morphologique peut également être observé lorsque les nanoparticules sont contenues dans un hydrogel.

Pour cela, des hydrogels de fibrine et fibrine-amidon contenant des NPe ont été préparés puis dégradés par incubation de l’hydrogel dans une solution de trypsine. Les échantillons sont ensuite dilués dans l’eau, déposés sur une pastille de carbone, séchés, puis métallisés à l’or pour être observés au MEB (Figure 73).

Figure 73 : Evolution de la morphologie des NPe ayant été contenues dans des hydrogels, observée en microscopie électronique à balayage. Les images représentent les NPe ayant été contenues dans des hydrogels

de fibrine ou fibrine-amidon après différents temps d’incubation à 37°C. La barre d’échelle est de 3 µm. L’analyse a été effectuée à 20 kV.

Le protocole expérimental mis en place permet bien d’observer au MEB les nanoparticules contenues initialement dans les hydrogels de fibrine et de fibrine-amidon. Cependant, les nanoparticules semblent recouvertes, modifiant leur morphologie. Cette différence est sûrement due à la présence de protéines (fibrine et trypsine) dans l’échantillon, qui pourrait former une couche protéique autour des nanoparticules.

Il est tout de même important d’observer que des différences sont visibles entre les nanoparticules contenues dans l’hydrogel de fibrine et celles contenues dans l’hydrogel de fibrine-amidon. Il semblerait que les NPe contenues dans l’hydrogel de fibrine s’agrègent dès 7 jours d’incubation, alors que celles contenues dans l’hydrogel de fibrine-amidon semble s’agréger à partir de 14 jours.

Cette différence pourrait s’expliquer par la différence de quantité de NPe présentes au sein de l’hydrogel. En effet, d’après ces observations de MEB, les nanoparticules contenues dans l’hydrogel de fibrine-amidon semblent moins nombreuses que celles contenues dans l’hydrogel de fibrine. Ceci semble logique puisqu’il a été montré précédemment que dans hydrogel de fibrine, la quasi-totalité des nanoparticules restent piégées au sein du réseau, alors qu’en présence d’amidon, 40% des nanoparticules ont été libérées de l’hydrogel au bout de 6h.

De plus, après 14 jours d’incubation, les NPe contenues dans l’hydrogel de fibrine-amidon semblent être plus agrégées que celles contenues dans l’hydrogel de fibrine. Cette différence d’agrégation peut s’expliquer par le fait que l’ajout d’amidon dans la formulation de l’hydrogel conduit à une augmentation de l’hétérogénéité du matériau et que, l’amidon présent au sein de cet hydrogel peut être hydrolysé, même partiellement par l’AMG présente dans les NPe, créant de plus grands espaces de diffusion pour ces nanoparticules.

L’étude du comportement des nanoparticules d’un point de vue de leur stabilité a permis de mettre en évidence que, de par leur neutralité, les nanoparticules ont tendance à s’agréger.

En solution, les nanoparticules s’agrègent vers 7 à 14 jours d’incubation, avec un pic d’agrégation atteint après 14 jours. Cette agrégation est caractérisée par une augmentation du diamètre hydrodynamique moyen et de l’indice de polydispersité des nanoparticules ainsi que par une modification de leur morphologie. Par ailleurs, il a été observé par MEB que la taille des nanoparticules isolées ou contenues dans les agrégats diminue au cours du temps, indiquant que les nanoparticules se dégradent progressivement.

En hydrogel, les nanoparticules s’agrègent également vers 7 jours d’incubation, mais la taille des agrégats ne semble pas augmenter entre 7 et 14 jours. En effet, il a été observé que les agrégats formés au sein des hydrogels semblent plus petits que ceux observés en solution, indiquant que le réseau de fibrine pourrait ralentir l’agrég ation des nanoparticules observée en solution. Cependant, des différences semblent être observées entre les NPe contenues dans l’hydrogel de fibrine et celles contenues dans l’hydrogel de fibrine-amidon. En effet, l’agrégation des NPe au sein de l’hydrogel de fibrine-amidon semble plus importante. Cela pourrait s’expliquer par l’hydrolyse de l’amidon par les NPe qui conduirait à un réseau plus lâche, permettant aux NPe de diffuser plus facilement au sein de l’hydrogel et ainsi de faciliter leur agrégation .

II.3. Production de glucose par l’AMG libre ou encapsulée

L’encapsulation de l’AMG dans les nanoparticules doit permettre la production de glucose au sein d’un hydrogel de fibrine-amidon sur 1 mois. L’étude et la comparaison de la production de glucose par l’AMG sous forme libre ou encapsulée est donc un paramètre important à déterminer pour mettre en avant l’intérêt de l’utilisation des NPe.

II.3.1. Influence des conditions expérimentales sur l’activité de