L'hybridation in situ est une technique qui permet de localiser un gène dont on connaît la séquence sur une coupe de tissu (ici, coupes de cerveau de souris). Le principe repose sur la complémentarité des bases : deux séquences nucléotidiques complémentaires s'apparient de façon spéci que et forte entre elles. Le but est donc d'appliquer une sonde marquée sur une coupe de tissu. Cette sonde reconnait un gène spéci que, se xe dessus et le révèle par son marquage (ici, un marquage radioactif).
Au cours de ma thèse, c'est l'expression du facteur de transcription Zif268 qui a été étudiée. Ce facteur a la particularité d'être exprimé de façon immé- diate et transitoire après une stimulation neuronale (notamment une injection de cocaïne). Il serait de plus impliqué dans l'expression de gènes participant à la plasticité cérébrale (Knapska et Kaczmarek,2004).
7.2.1 Obtention et préparation des coupes
Les animaux sont euthanasiés par exposition au CO2 et leurs cerveaux
sont prélevés et congelés dans de l'isopentane. Ils sont ensuite sectionnés au cryotome en coupes coronales de 12 µm d'épaisseur montées sur lame (Superfrost/Plus, IL, USA).
Les lames sont séchées et stockées à -30◦C, puis subissent une étape de
post- xation au paraformaldéhyde 4 % (10 minutes, température ambiante), ceci a n de préserver structure et constituants cellulaires des coupes. Cette post- xation est suivie d'une étape d'acétylation, par incubation dans de l'an- hydride acétique (0.25 %) - triéthanolamine 0.1 M (10 minutes), dont le but est d'éliminer les bruits de fond et d'inactiver des ribonucléases pour aider à produire un signal d'hybridation plus fort. La préparation des lames nit par une déshydratation, un dégraissage dans du chloroforme (2 fois 5 minutes), une réhydratation et un séchage à l'air libre. Les lames peuvent alors être stockées à -30◦C jusqu'à l'étape d'hybridation.
7.2.2 Marquage des sondes
Des sondes (48-mer, Invitrogen, Rockville, MD, USA) complémentaires de l'acide ribonucléique messager (ARNm) du gène d'intérêt Zif268 ont été sélectionnées (séquence complémentaire aux bases 352 à 399, GenBank nu- méro d'accès M18416). Dans un premier temps, nous réalisons un marquage radioactif de ces sondes :
1. Mélange à température ambiante des sondes avec de l'eau distillée, une solution tampon, du chlorure de cobalt, du [33P]-dATP et de la
7.2. HYBRIDATION IN SITU : ZIF268 99 transférase terminale (qui catalyse l'addition des désoxynucléotides sur une fonction alcool 3'OH terminale de l'ADN) ;
2. Incubation au bain-marie à 38◦C (15 minutes) ;
3. Blocage de la réaction par l'ajout de Tris-EDTA.
Les oligonucléotides non marqués sont séparés par passage du mélange au travers d'une colonne Spin (mini Quick Spin Columns pour ARN ; Roche, no. 1 814 427). Les fractions marquées sont récoltées à la sortie de la colonne. Un échantillon de la sonde est ajouté à un cocktail de scintillation et la radioactivité est comptée (elle doit être comprise entre 800 000 et 1 500 000 coups par minute (cpm)).
7.2.3 Hybridation in situ
Les sondes oligonucléotidiques marquées sont mélangées à du tampon d'hybridation préalablement chaué à 37◦C (de manière à ce que 100 µl de
tampon contienne environ 3x106 cpm de sonde marquée) et placées à 56◦C
pendant 10 minutes. Elles sont ensuite ajoutées à chaque lame.
Les lames sont couvertes et placées sous incubation (37◦C, toute une nuit)
puis rincées : 4 lavages dans du citrate de sodium salin 1X, 3 lavages dans du citrate de sodium salin 2X/formamide 50 % (20 minutes à 40◦C), puis
2 lavages de nouveau dans le citrate salin 1X (30 minutes à température am- biante) a n d'éliminer toutes les liaisons non spéci ques ayant pu se former. Elles sont alors rincées à l'eau distillée et séchées sous ventilateur.
7.2.4 Révélation et analyse
La dernière étape consiste à mettre en évidence les hybrides spéci ques (sonde liée au gène d'intérêt) par autoradiographie (technique d'imagerie par laquelle la sonde radio-activement marquée laisse une empreinte sur un sup- port photographique). À la suite de l'hybridation, un bref rinçage à l'eau est réalisé puis les lames sont séchées et apposées à un lm sensible aux rayons X (BioMax MR-2, Kodak, NY, USA) pendant 6 jours pour révé- lation. Les lms obtenus sont numérisés au moyen d'une table lumineuse (Northern Light, Imaging Research, Ontario, Canada) et d'une caméra Sony CCD camera (Imaging Research), puis analysés par densitométrie (étude de la densité optique) grâce au logiciel ImageJ (Wayne Rasband, MD, USA).
Dans le cadre de ma thèse j'ai analysé l'expression de Zif268 dans 26 ré- gions corticales basées sur l'atlas dePaxinos et Franklin(2001) et dans 23 sec- teurs du striatum dé nis par leurs aérences corticales (Willuhn et al.,2003), ceci à 4 niveaux sur le plan rostro-caudal : frontal (environ +1.98 mm par
rapport au Bregma), rostral (+1.18 mm), middle (+0.74 mm), et caudal (−0.22 mm). Les régions sont détaillées dans la gure 7.2.
FrontaleB+1.98) MiddleeB+0.74) M2 Cg SS M1 I Pir d dl m v vl c
Frontal Rostral Mid
dle Caudal CaudaleB-0.22) M2 Cg SS M1 I Pir d dl m v vl vc dc A B IL PrL M2 M1 I/LO Pir S1 Cg RostraleB+1.18) d dl m mC v dm mS vS lS lC M2 Cg SS M1 I Pir
Figure 7.2 Schéma représentant A/ les diérents plans de coupe et la position de l'embase (en rouge) et B/ les régions du cortex (IL, infralim- bique ; PrL, prélimbique ; Cg, cingulaire ; M2, moteur secondaire ; M1, mo- teur primaire ; S1, somatosensoriel primaire ; SS, somatosensoriel ; I/LO, insu- laire/orbitaire latéral ; I, insulaire ; Pir, piriforme) et du striatum (m, médial ; dm, dorsomédial ; d, dorsal ; dl, dorsolatéral ; dc, dorsal central ; c, central ; vc, ventral central ; vl, ventrolatéral ; v, ventral. Noyau accumbens : mC et lC, c÷ur médial et latéral ; mS, vS et lS, coquille médiale, ventrale et latérale) étudiées.
8 Traitement des résultats
8.1 Présentation des données
Les résultats de chaque étude sont représentés sous forme d'histogrammes (paramètre comportemental testé, eet dose-réponse d'une drogue...) ou de courbes (décours temporel, apprentissage...) par la moyenne et l'erreur type (standard error of the mean, SEM). L'eectif des groupes (la plupart du temps, au minimum de 8 animaux/groupe) sera précisé pour chaque étude.
Lorsqu'une diérence est statistiquement signi cative entre deux groupes, elle est représentée par des symboles (tels que l'astérisque *) dont le nombre varie en fonction du niveau de signi cativité (* pour p≤0.05, ** pour p<0.01, et *** pour p<0.001).