B HSF1 se lie aux satellites 2 et satellites 3

Afin d’identifier les chromosomes cibles de ces GS, une expérience de reconstitution de granules in vitro a été effectuée. Le principe de cette approche est la suivante: une protéine HSF1 recombinante est incubée sur des chromosomes métaphasiques avant d’être détectée par immunofluorescence (Jolly, Konecny et al. 2002). De part l’absence de régulateurs négatifs, la protéine HSF1 recombinante possède les mêmes propriétés de liaison à l'ADN que les trimères actifs d’HSF1 induits par le stress (Kroeger, Sarge et al. 1993). De manière très intéressante, les résultats varient en fonction de la quantité de protéine HSF1 utilisée. Ainsi, seulement deux signaux sont observés sur les deux chromosomes 9 en présence de faibles quantités de protéines (50-100 ng) (Jolly, Konecny et al. 2002) (Figure 53-A). En revanche, lorsque des quantités plus importantes de protéines HSF1 ont été utilisées (2-5 µg), plusieurs signaux fluorescents sont détectés sur d'autres chromosomes (Figure 53-A).

B

A

Figure 53 : (A) Reconstitution in vitro des granules de stress. Les chromosomes métaphasiques

humains ont été incubés avec 500 ng (à gauche) ou 5 µg (à droite) de protéine HSF1 recombinante. Celle-ci a ensuite été détectée par immunofluorescence (rouge). Avec 500 ng de protéines, deux signaux fluorescents sont détectés sur les deux chromosomes 9 (flèches blanches). Avec 5 µg de protéines, de nombreux signaux sont observés sur les régions péricentromériques de plusieurs autres chromosomes (flèches jaunes). (B) Caryotype de la métaphase présentée figure A (à droite). Les chromosomes présentant un signal fluorescent sont numérotés en rouge.

Grâce aux caryotypes réalisés à partir de trois expériences indépendantes, nous avons identifié les différents chromosomes capables de lier HSF1. Il s’agit des chromosomes 1, 5, 7, 9, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22 et Y (Figure 53-B). Ces

chromosomes peuvent être classés en fonction de la taille des signaux obtenus pour HSF1 : 9, Y, 1, chromosomes acrocentriques, 16, 17, 10, 7 et 5.

Une approche in vivo a également été utilisée pour confirmer ces observations in vitro. Profitant du fait que les granules de stress ne se forment pas dans les cellules de rongeurs, nous avons analysé par immunofluorescence la distribution du facteur HSF1 après un choc thermique dans des lignées hybrides Homme-hamster qui ne contiennent qu’un seul chromosome humain. Comme le montre la Figure 54, les chromosomes capables de lier HSF1 dans l’expérience de reconstitution de granules in vitro (à l'exception des chromosomes 1 et 16) sont également en mesure de diriger la formation de foyers HSF1 dans ces lignées cellulaires hybrides. Contrairement à l’expérience de reconstitution in vitro, le chromosome 4 semblerait être également une cible chromosomique d’HSF1. Cette exception peut s’expliquer par le fait que cette lignée hybride en particulier aurait pu conserver une partie d’un autre chromosome humain, comme cela a été décrit pour d’autres lignées humaines hybrides (Antonacci, Marzella et al. 1995). De même, l'incapacité des chromosomes 1 et 16 à diriger la formation des foyers HSF1, pourrait être liée à des réarrangements génomiques conduisant à la perte des régions péricentromériques. De plus, certaines lignées cellulaires hybrides sont instables et peuvent perdre le chromosome humain assez facilement lorsqu’elles sont mise en culture, et ce même sous des conditions de pression de sélection.

17 21 22 Y

4 5 7 9

10 13 14 15

Figure 54 : Analyse par immunofluorescence de la distribution d’HSF1 dans des lignées cellulaires

hybrides Homme-hamster exposées à une heure de choc thermique à 43 °C. Une granule de stress est observée dans le noyau des cellules de rongeurs qui contiennent l’un des chromosomes suivants : 4, 5, 7, 9, 10, 13, 14, 15, 17,21, 22 ou Y.

Pour confirmer que les chromosomes identifiés comme des cibles d’HSF1 sont en effet capables de lier HSF1 in vivo dans des cellules humaines, nous avons combiné des expériences d'immunofluorescence et de FISH ADN pour la détection simultanée d’HSF1 et des centromères de certains chromosomes cibles. Comme le montre la Figure 55, HSF1 est détecté à proximité des centromères des chromosomes 15, 16 et 17, confirmant ainsi que ces chromosomes sont capables de lier HSF1 in vivo.

D

cen15

cen16

cen17

HSF1 superposition

Figure 55 : Codétection d’HSF1 et du centromère du chromosome 15 (panneau supérieur), 16

(panneau médian) ou 17 (panneau inférieur) par immunofluorescence (vert) et par FISH ADN (rouge) dans des cellules HeLa exposées à une heure de choc thermique. Les granules de stress sont toujours détectées à proximité de ces centromères.

Il est important de noter que, dans les expériences de reconstitution de granules de stress in vitro, toutes les cibles d’HSF1 sont situées au niveau des régions péricentromériques des chromosomes, à l’exception du chromosome Y pour lequel HSF1 se lie sur le bras long (Figure 53-A). Toutes ces régions sont connues pour être enrichies en séquences répétées de type satellites 2 et/ou 3 (Frommer, Paul et al. 1988; Tagarro, Fernandez-Peralta et al. 1994). Pour confirmer le fait qu’HSF1 puisse en effet lier les satellites 2 et 3, nous avons réalisé une expérience de gel retard en utilisant la protéine HSF1 recombinante ainsi que plusieurs sondes. Des sondes représentant les satellites 1, 2 et 3 ainsi que des sondes reconnaissant de manière spécifique les satellites 2 des chromosomes 1 et 16. D’autre part, la sonde HSE qui contiennent le motif consensus de laissions à l’ADN d’HSF1 ainsi qu’une sonde

(Jolly, Konecny et al. 2002). Comme le montre la Figure 56, en présence d’une grande quantité d’HSF1, un retard de migration très net est observé avec les différentes sondes satellites 2 et 3 alors qu’un retard modéré est détecté pour les séquences satellites 1. Ainsi ces observations confirment l’affinité d’HSF1 pour les séquences satellites 2 et 3.

E

sonde

HSF1 (ng)

sat III sat III sat II sat II sat II sat II sat I

9q12 HSE cons 16q12 1q12 cons1 cons2 cons HSE

-retard

Figure 56 : Gel retard réalisé avec différentes sondes représentant les satellites 1, 2 ou 3. La sonde

HSE est utilisée en contrôle positif. Chaque sonde a été incubée avec 100 ou 500 ng de protéine recombinante HSF1. La sonde HSE libre est présentée dans la dernière piste. Un retard de migration est détecté pour toutes les sondes satellites 2 et 3 en présence de 500 ng de protéine. Un retard mineur est observé avec la sonde spécifique des satellites 1

I.3.C La formation des granules de stress secondaires est