La déméthylation de l’ADN n’empêche pas la formation des granules de stress

F 1 /T u b u li n e A B 0 0,5 1 37 HS 37 HS 37 HS HSF1 Tubuline 37 HS R 37 HS R HSP70 Actine Ctl ICF C

Figure 79 : La réponse au stress « classique » est fonctionnelle dans les cellules ICF. A La mobilité

électrophorétique d’HSF1 dans des extraits protéiques issus de cellules ICF et de cellules contrôles soumises (HS) ou non (37) au choc thermique a été analysée par western blot en utilisant un anticorps anti-HSF1. Le retard de migration d’HSF1 observé dans les extraits protéiques de cellules ICF et de cellules contrôles soumises au choc thermique reflète la présence de modifications post-traductionnelles de la forme active d’HSF1 (flèche). B La quantification de la protéine HSF1 est obtenue, grâce à ImageJ, en calculant le ratio HSF1/tubuline. C HSP70 est détectée par western blot dans les cellules ICF et dans les cellules contrôles soumises à une cinétique de choc thermique (37: cellules non stressées, HS: 1h de choc thermique à 45°C, R: 3h de récupération à 37°C après une heure de choc thermique à 45°C). HSP70 est exprimée au cours du stress, dans les cellules ICF et dans les cellules contrôles, d’une manière similaire.

3. La déméthylation de l’ADN n’empêche pas la formation des granules de stress

Nous nous sommes demandé si l'absence de relocalisation d’ HSF1 au locus 9q12 ainsi que de l'absence de transcription des séquences répétées ne pourrait pas être due à une délétion de ces séquences satellites 3 dans les cellules ICF. Une expérience de FISH ADN a donc été effectuée dans des cellules ICF en utilisant une sonde spécifique des séquences satellites 3 du locus 9q12, la sonde pHuR98. Deux signaux

d'hybridation, correspondant aux deux loci 9q12, sont observés dans le noyau des cellules ICF (Figure 80). L’intensité et la taille de ces signaux est comparable à celles des cellules contrôles. Ce résultat suggère donc que l'absence d’ HSF1 au locus 9q12 dans les cellules ICF n'est pas due à une perte des séquences satellites 3.

Ctl ICF

Figure 80 : Les séquences génomiques satellites 3 du locus 9q12 sont présentes dans les cellules

ICF. Les séquences satellites 3 présentes au sein du locus 9q12 sont détectées par FISH ADN à l’aide d’une sonde spécifique, pHuR98. La présence de deux signaux d’hybridation dans les cellules ICF et dans les cellules contrôles indique l’absence d’une délétion de ce locus dans les cellules ICF.

L'absence de granules de stress dans les cellules ICF soumises à un choc thermique pourrait s’expliquer par l’incapacité du facteur HSF1 à se lier sur des séquences déméthylées. Pour tester cette hypothèse, nous avons utilisé une tecchnique de reconstitution de granules, décrite dans l’article n°1, qui consiste à incuber une protéine HSF1 recombinante sur des chromosomes métaphasiques provenant de cellules issues de patients atteints par le syndrome ICF. La protéine HSF1 est ensuite détectée par immunofluorescence classique. Comme on peut le voir sur la Figure 81-A, deux signaux fluorescents correspondant aux sites de liaison d’HSF1 sur les chromosomes 9 sont détectés dans les cellules ICF (flèches) Ces signaux sont comparables à ce que l’on peut obtenir avec des cellules normales (Jolly, Konecny et al. 2002). Ainsi, les séquences satellites 3 des cellules ICF, bien que déméthylées, sont parfaitement capables de lier la protéine HSF1 recombinante. Pour confirmer ces résultats, nous avons réalisé une immunofluorescence dirigée contre HSF1 dans des cellules déficientes en DNMT3b seule (3bKO) ou en combinaison avec la DNMT1 (DKO). En effet, l’absence de ces protéines conduit à la déméthylation des séquences satellites péricentromériques (article n°3 : Horard B, Eymery A et al, en préparation). Comme on peut le constater sur la Figure 81-B, la déméthylation de l’ADN au niveau du locus 9q12 n’empêche pas la formation des foyers HSF1. Ainsi, ces résultats excluent la possibilité que l'absence de relocalisation d’HSF1 au locus 9q12

dans les cellules ICF puisse être la simple conséquence d’une déméthylation de ce locus.

Dapi HSF1-Rec Superposition

A

B _{3bKO DKO}

Figure 81 : Les séquences satellites 3 déméthylées sont capables de lier HSF1. A Les granules de

stress ont été reconstituées in vitro en incubant une protéine HSF1 recombinante (HSF1-rec) avec des étalements de chromosomes métaphasiques provenant de cellules ICF. La protéine est ensuite détectée par immunofluorescence. Deux signaux sont observés sur les deux loci 9q12 (flèches), indiquant qu’HSF1 est parfaitement capable de se lier aux séquences satellites 3 déméthylées. B La protéine HSF1 est détectée par immunofluorescence dans des cellules déficientes en DNMT3b seule (3bKO) ou en combinaison avec la DNMT1 (DKO), soumises à un choc thermique. Des granules de stress sont observées dans ces deux lignées cellulaires soumises au choc thermique indiquant ainsi que la déméthylation des séquences satellites 3 n’empêche pas la liaison d’HSF1.

Enfin, une dernière interrogation demeurait quant à la capacité transcriptionnelle de ces séquences satellites déméthylées au cours du choc thermique. Pour répondre à cette question, nous avons évalué, par une approche transcriptomique, le taux d’ARN issus des séquences satellites péricentromériques (contenant les séquences satellites 3 du locus 9q12) au cours de la réponse au stress, dans des cellules 3bKO et DK0. Les résultats sont présentés dans la Figure 82. Ces cellules sont incapables, tout comme les cellules ICF de transcrire les séquences répétées en absence de stress. Cependant,

lorsqu’elles sont soumises à une cinétique de choc thermique, les séquences satellites péricentromériques sont transcrites.

0 250 500 750 1000 0 0,5 1 1,5 2

37 HS REC 37 HS REC 37 HS REC

HCT116 3bKO DKO In te n s it é d e s ig n a l Gènes contrôles Séquences satellites

Figure 82 : Les séquences satellites déméthylées sont transcrites au cours du choc thermique.

L’expression des séquences satellites, comprenant les séquences satellites 3 du locus 9q12, a été évaluée par approche transcriptomique dans des cellules HCT116 normales ou déficientes en DNMT3b (3BKO) ou en DNMT3b et DNMT1 (DKO). Les résultats ont été normalisés par rapport aux données obtenues dans les HCT116 normales (cellules dans lesquelles les délétions de dnmt3b et dnmt1 ont été réalisées) non stressées. En absence de stress aucune de ces lignées ne présente de transcription des séquences satellites. Cependant au cours de la cinétique de choc thermique, des ARN issus des séquences satellites sont détectés pour les trois lignées. Ainsi, la déméthylation des séquences satellites n’empêche pas leur transcription au cours de la réponse au stress.