L’étude de la répartition de la recombinaison méiotique le long des chromosomes est, de manière classique, réalisée à partir de l’étude globale des SNP dans des populations issues de croisement entre deux individus suffisamment différents pour qu’une majorité des SNP soit polymorphe entre ces deux individus (Figure 40). Un SNP aura donc minimum deux versions provenant soit du parent 1 soit du parent 2. Ainsi, lors d’une marche sur un chromosome, si l’origine des SNP change passant d’un parent à l’autre, alors on peut traduire ceci par l’apparition d’un point de recombinaison entre les deux SNP entre lesquels le changement a eu lieu. Ici nous appliquons la même technique de détection des points de recombinaison mais à l’échelle locale. Il nous faut donc travailler sur une population issue d’un croisement entre deux variétés de blé tendre de provenances différentes. L’identification de l’apparition d’un point de recombinaison au niveau de la cible du système SpiX se fait de la même manière par l’identification de la provenance des portions génomiques de part et d’autre de la cible SpiX grâce à des SNP.
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Figure 41 : Technologie de génotypage KASPar. a : les composants de la réaction sont mis en contact. La matrice ADN comportant le SNP, le trio de primers (une amorce commune et deux amorces spécifiques des deux allèles du SNP, couplées chacune à une séquence complémentaire d’une des deux cassettes FRET du master mix). b : 1er cycle PCR. Une fois la matrice dénaturée, l’amorce spécifique du SNP présent sur la matrice va s’hybrider avec celle-ci et l’amplification va avoir lieu. c : 2ème cycle PCR. L’amplicon créé lors du 1er cycle va servir de matrice à l’amorce commune et l’amplification va continuer. d : 3ème cycle PCR. L’amplicon complémentaire créé lors du 2ème cycle contient maintenant la séquence complémentaire de la cassette FRET et cette dernière, dénaturée, va s’hybrider. Le fluorochrome (F ou H) et le quencher (Q) sont ainsi dissociés et le fluorochrome émet de la lumière après excitation. e : Produit final. Le SNP est maintenant associé à un fluorochrome (séparé de son quencher) et donc à un signal lumineux précis suivant excitation avec la bonne longueur d’onde. (Smith and Maughan, 2015)
a
b
d
c
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Stratégie
La stratégie de génotypage des SNP retenue est la technologie KASPar (Figure 41) (264) qui consiste en une PCR faisant intervenir trois amorces : une commune dessinée dans une région non polymorphe et deux allèle-spécifiques incorporant un SNP identifié entre les deux parents du croisement et couplées chacune à un fluorophore différent. L’amorce commune sera normalement utilisée pour la réaction de PCR quel que soit l’individu. En revanche, les amorces spécifiques seront utilisées pour la réaction en fonction de l’allèle porté par l’individu génotypé et celle utilisée émettra alors une fluorescence grâce au fluorophore libéré. Ainsi en calculant le ratio de la fluorescence d’un fluorophore sur l’autre on peut savoir quelle amorce a été utilisée préférentiellement dans la réaction de PCR et donc quel allèle a été hérité par l’individu génotypé et descendant du croisement.
Recherche de marqueurs
Cette stratégie repose sur la présence d’un polymorphisme suffisant entre les deux parents utilisés pour la production d’embryons hybrides pour que les régions ciblées par la technologie SpiX possèdent un minimum des SNP identifiés entre les deux parents du croisement. Afin de pouvoir trouver les SNP permettant la mise au point du génotypage par technologie KASPar, une marche sur le génome est effectuée en s’éloignant de part et d’autre de la cible SpiX. Dès qu’un SNP polymorphe entre les deux parents est découvert, les amorces sont dessinées et testées avec le protocole KASPar (voir chapitre 3.8.3). A chaque amorce spécifique de chaque allèle est accolée une extension spécifique d’un fluorophore pour la distinction entre l’un ou l’autre des deux allèles lors de la lecture. Trois types de marqueurs ont été utilisés pour la recherche de polymorphisme entre les deux parents : des marqueurs SNP, des marqueurs SSR et des marqueurs ISBP (Insertion
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Figure 42: Découverte de SNP de novo par crible de marqueurs ISBP. a: représentation d’une courbe de dissociation de produits PCR obtenus pour le même marqueur ISBP pour chacun des parents, Chinese Spring en bleu et Courtot en rouge. Le delta température entre les deux courbes est indiqué par la double flèche verte. b: résultats du séquençage des amplicons PCR du marqueurs pour les deux parents. Le SNP découvert est indiqué dans le cadre rouge.
a
b
Table 6 : programme PCR de protocole KASPar.
Température (°C) Temps Nombre de cycle Etape
94 15min 1 Dénaturation 94 65 20sec 1min 10 avec un delta de -0.8°C par cycle Dénaturation Hybridation 94 57 20sec 1min 40 Dénaturation Hybridation 15 infini 1 Stase
156 site-based polymorphism) (265). Ces derniers ont servi à la détection de novo de marqueurs SNP par analyse des températures de dissociation de produit PCR issus de la même amplification chez les deux parents (Figure 42) (protocole en Annexe 4).
Protocole
Le réactif KASPar v4.0 2X Reagent Mix Low Rox (LGC Genomics, KBS-1016-017) est utilisé afin de réaliser le génotypage. Un mix des amorces est réalisé au préalable afin de le rajouter au mix KASPar final. Dans un tube 1,5 mL ,12 µL de l’amorce spécifique de l’Allèle 1 (100µM, 12 µM final) est mélangé à 12 µL de l’amorce spécifique de l’Allèle 2 (100µM, 12 µM final) et à 30 µ L de l’amorce commune (100µM, 30 µM final). Enfin 46 µL d’eau up autoclavée sont rajoutés pour arriver à un volume final de mix d’amorces de 100 µ L. Pour chaque réaction KASPar, le mix final est réalisé en mélangeant 2µ L d’ADN à 10ng/µL, 2µ L du KASPar v4.0 2X Reagent Mix Low Rox (LGC Genomics, KBS-1016-017) et 0.055µL de mix d’amorces.
La PCR pour le génotypage KASPar est réalisée dans une plaque 384 blanche spéciale LightCycler 480 (LightCycler® 480 Multiwell Plate 384, white, Roche, référence : 04729749001) selon le programme indiqué en Table 6. Le protocole complet est indiqué en Annexe 5.
Lecture et analyse des résultats
La lecture est effectuée en point final sur le robot LightCycler 480 II (LC480) de Roche par l’intermédiaire du logiciel LightCycler ® 480 SW 1.5. L’analyse est effectuée sur le même logiciel
et évaluée à la main. Les recombinants sont détectés lorsque le génotype est différent entre les deux
SNP étudiés, ce qui veux dire qu’ils proviennent de parents différents et qu’il y a donc eu recombinaison entre les deux marqueurs.
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4 RESULTATS
’objectif de cette thèse était d’évaluer les facteurs essentiels au ciblage de la recombinaison chez le blé tendre afin de l’améliorer et de la diriger vers des zones qui en sont habituellement dépourvues. Pour atteindre cet objectif, il était avant tout nécessaire d’établir une stratégie optimale permettant de produire les résultats dans les temps impartis. Contrairement aux espèces modèles qui disposent d’outils performants (lignées fluorescentes chez Arabidopsis par exemple) ou qui ont des temps de génération réduits, la recombinaison chez le blé ne peut être mesurée que sur des descendants d’hybrides. L’intervalle de graine à graine est d’environ six mois. Nous avons donc dû élaborer un protocole adapté concernant la production d’embryons immatures hybrides ce qui constituera la première partie des résultats. La deuxième partie sera consacrée à l’analyse détaillée du gène Spo11-1 chez le blé et qui sert à l’élaboration des constructions destinées au ciblage. La dernière partie présentera enfin les premiers résultats issus des transformations initiales.