Production des embryons immatures
Nous avons choisi pour la production d’embryons immatures hybrides les variétés Chinese Spring (CS), un blé de printemps référence mondiale pour le séquençage du génome du blé, et Courtot (Ct) un blé d’hiver européen, référence locale pour la transformation par Biolistique du blé tendre. Afin d’éviter toute possibilité d’obtenir des évènements de transformation issus de l’autofécondation d’un des deux parents, le croisement n’est effectué que dans un sens, CS en tant que femelle et Ct en tant que mâle. En effet, CS est considéré comme une variété difficilement transformable par biolistique alors que Ct est le génotype de référence utilisé au laboratoire. Ainsi, un individu issu d’une autofécondation CS aura peu de chance d’être transformé. Le taux de
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Figure 43 : Pourcentage de réussite au croisement au cours d'une année. Une moyenne de deux croisements par semaines a été réalisée de 2014 à 2018 lors des campagnes de croisement. Les données de ces campagnes ont été regroupées par mois et le ratio a été calculé en fonction du nombre de fleurs castrées et pollinisées sur le nombre de grains obtenus par mois.
162 réussite des croisements fluctue grandement suivant la période de l’année, allant de 16% au mois de juillet à 67% au mois de décembre, avec une moyenne de 44% (Figure 43). En prenant en compte tous les croisements effectués entre 2014 et 2018 entre ces deux variétés dans les mêmes conditions climatiques contrôlées, nous observons alors une plus forte obtention de grains immatures dans la période automnale et à la fin de l’hiver/début de printemps. En dehors de ces périodes, le taux d’obtention d’embryons immatures reste relativement bas. Pour optimiser le temps et le coût d’une expérimentation de Biolistique, il apparaît alors que la production d’embryons immatures hybrides doit être améliorée afin d’en avoir un nombre suffisant à transformer en même temps. Etant donné le temps nécessaire pour réaliser un croisement et la faible disponibilité du pollen de Courtot, nous ne pouvions pas augmenter le nombre de croisements réalisés en même temps. C’est ainsi que nous avons décidé d’optimiser leur conservation et notamment en stockant les grains immatures fraichement récoltés dans des tubes de 50 mL fermés et à 4°C.
Conservation de grains hybrides immatures pour la biolistique
4.1.2.1 Introduction
La transgénèse par biolistique d'embryons immatures est un moyen efficace d'introduire artificiellement de nouveaux gènes dans le blé tendre. Cependant, seuls quelques génotypes peuvent être transformés efficacement. De plus, comme vu précédemment, l’obtention d’une descendance après croisement entre deux variétés de blé tendre peut être aléatoire selon la saison et ne pas être suffisante pour des expériences de biolistique. Dans l’article suivant publié dans la revue PCTOC, j’ai stocké des grains immatures, hybrides ou non, à température ambiante ou à 4 ° C pendant 4 ou 7 jours avant de les extraire pour la transformation par biolistique.
4.1.2.2 Cold-conserved hybrid immature embryos for efficient wheat transformation (PCTOC).
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4.1.2.3 Principales conclusions
Le fait de séparer le grain immature de l’épi stoppe la croissance de l’embryon et presque tous les embryons soumis à ce traitement forment un cal sur un milieu sélectif lorsqu’ils sont conservés à 4 ° C pendant 4 ou 7 jours (respectivement 87% et 99%). Nous avons également utilisé des embryons hybrides immatures issus d'un croisement entre une lignée transformable (Courtot) et une lignée non transformable (Chinese Spring) pour la transformation biolistique. Les embryons hybrides conservent la même transformabilité que le parent répondant le mieux à la biolistique. Dans l'ensemble, ces résultats améliorent considérablement le protocole biolistique de transformation du blé en réduisant le nombre de plantes mères en serre et améliorent la transformation de génotypes supplémentaires par le biais d'une transformation hybride. Enfin, le fait de pouvoir transformer des hybrides permet d’envisager un gain de temps substantiel pour la suite du projet.
Résultats de la transformation des embryons immatures et plantes T0
Les résultats des transformations ont été assez variables suivant les épisodes de transformation, mais dans l’ensemble le taux de transformation reste assez stable, autour de 0,7%. Sur 21910 embryons transformés au total, 159 plantes ont été générées dont 71 sont transgéniques pour la construction SpiX. Le taux de plantes positives pour le gène de sélection PMI est en moyenne 30% supérieur au taux de plantes positives pour la construction SpiX. Ceci est dû au fait que les deux constructions sont utilisées en co-bombardement, donc indépendante l’une de l’autre, et que la probabilité théorique de retrouver à la fois l’une et l’autre de ces constructions insérées dans le génome de l’embryon transformé est de 30%.
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Figure 44 : Semences T1 collectées à partir d'épis transgéniques T0. Les grains sont placés dans des sachets en
plastique représentant chacun une plante transgénique T0. Les sachets sont placés en chambre de stockage à une température de 7°C pour la levée de dormance.
182 Les plantes transformées ont une croissance tout à fait normale, l’étape critique étant située essentiellement au niveau de la culture in vitro et plus précisément lors de la sélection sur le milieu PMI3 et MSOPMI. En effet, une tendance à perdre la majorité des plantes sélectionnées sur les milieux PMI1 et PMI2 a été remarquée.
Une fois en serre, celles-ci conservent un rythme de croissance normale et présentent toutes le même phénotype, confirmant ainsi l’hybridation entre CS et Ct (Figure 38). La plante conserve la taille moyenne des plantes de CS et présente des épis barbus, caractéristiques de Ct. La floraison à lieu normalement au bout de six semaines suivant la sortie de vernalisation, néanmoins quelques plantes fleurissent jusqu’à une semaine en avance. Le nombre moyen d’épis est de 10 par plante et les cas de stérilité sont marginaux (2%). Le rendement est stable avec en moyenne 20 grains par épis, mais la quantité de grain étant fonction du nombre d’épis, la récolte varie fortement d’une plante à l’autre (Figure 44). Ce matériel sera utilisé ultérieurement pour l’analyse des variations du taux de recombinaison (voir chapitre 4.4.2).