La technique de production de plantes transgéniques retenue est celle de la biolistique suivie d’étapes de régénération in vitro sur milieu de sélection. Cette technique requiert comme matériel de base des embryons immatures de blé tendre. La liste et la composition des milieux sont indiquées en Annexe 2.
Extraction des embryons
Dans des conditions stériles, les grains immatures sont lavés dans une solution d'hypochlorite de sodium à 20%, additionnée d'une goutte de tween 20 pour 200 mL puis rincés à l'eau distillée autoclavée et séchés. Les embryons immatures sont isolés sous loupe binoculaire dans des conditions stériles. Le grain immature est sectionné en partie basale afin de libérer l’embryon (Figure 35). La radicule de celui-ci est ensuite retirée pour empêcher la germination spontanée de l’embryon. Le reste de l’embryon composé du scutellum et du coléoptile est transféré à l'envers sur un milieu solide de plasmolyse, préalablement coulé dans une boîte de Pétri stérile de petit diamètre. Les embryons ainsi disposés sur le milieu de plasmolyse sont laissés minimum 3h à 30°C afin de laisser le temps aux cellules de parfaire la plasmolyse. Cette étape de plasmolyse est indispensable car elle va permettre aux cellules de se vider de leur eau afin d’être moins sensibles à l’éclatement lors du bombardement de particules.
Biolistique
Le bombardement de particules est effectué à l'aide de l’appareil BioRad PDS 1000 He avec un disque de rupture calibré à 900 psi et une distance à la cible de 7 cm (Figure 36). Toutes les manipulations doivent être effectuées dans des conditions stériles. Les disques de rupture et les
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Figure 37 : Les étapes de culture in vitro suivant la transformation par biolistique des embryons immatures. a : un embryon juste après la transformation. b : Étape de callogenèse (milieu MSE3). c : Première étape d'organogenèse (feuilles) sur le premier milieu de sélection PMI1. d : Développement des feuilles sur le deuxième milieu de sélection PMI2. e : Développement des feuilles sur le troisième milieu de sélection PMI3. f : Seconde étape d'organogenèse (racines) et développement des feuilles sur le milieu de sélection MSO-PMI, juste avant le transfert en serre.
146 disques supports sur lesquels est déposé l’ADN sont lavés à l'éthanol et laissés à sécher. Un tube contenant un aliquot de 1 mg de billes d'or de 0,6 µm de diamètre repris dans 20 µL d'éthanol est placé sous sonication pendant 5 min afin de séparer les particules d'or les unes des autres en douceur. Chaque cassette de construction plasmidique est ajoutée aux billes d’or en quantité équimolaire sans dépasser la quantité totale de 1 µ g d'ADN. 20 µL de spermidine à 0,1 M et 50 µL de CaCl2 à 2,5 M sont ensuite mélangés dans un autre tube avant d’être ajoutés au mélange billes/ADN. La solution obtenue est vortexée doucement pendant au moins 15 minutes, puis centrifugée pendant 1 minute. Le surnageant est jeté et le culot de billes est lavé avec 200 µL d'éthanol anhydre, centrifugé et remis en suspension dans 100 µL d'éthanol anhydre. 10 µ L sont utilisés pour chaque tir et sont soigneusement déposés sur un disque support préalablement placé sur un support de montage conformément au manuel d'utilisation du dispositif BioRad PDS 1000 He. Le montage final est effectué comme décrit dans le manuel d'utilisation du dispositif BioRad PDS 1000 He. La boîte de Pétri contenant les embryons immatures plasmolysés est ouverte sous conditions stériles et placée à l'intérieur du dispositif BioRad PDS 1000 He à une distance de 7 cm du disque de rupture. Ensuite, le tir est effectué conformément au manuel d'utilisation. Une fois le bombardement de particules terminé, la boîte de Pétri est refermée et placée à 30°C pendant une nuit avant de commencer le protocole de culture in vitro.
Culture in vitro
La culture in vitro a été réalisée comme décrit dans Tassy et al. en 2014 (261), sur des milieux sélectifs enrichis au mannose qui permet la sélection des plantes transformées qui portent un gène codant pour une Phospho-Mannose Isomérase (PMI) et qui sont donc aptes à métaboliser le mannose (262, 263) (Figure 37). Cette sélection est divisée en plusieurs étapes de multiplication
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Figure 38 : Acclimatation des jeunes plantules à la sortie de l’étape de culture in vitro. Les jeunes plantules sont
délicatement sorties du milieu gélosé et sont repiquées dans un terreau spécial semis, mises à baigner dans un bac d’eau pendant une journée et placées dans une armoire de culture dont la température et l’humidité sont contrôlées.
148 cellulaire et de régénération des tissus. Après une nuit à 30°C, les embryons immatures fraîchement transformés sont placés sur un milieu de callogenèse enrichi en 2,4-D pendant 2 semaines. Les cals générés sont transférés sur 2 milieux sélectifs consécutifs enrichis en mannose et en hormones végétales de synthèse (AIA, Acide indole 3-acétique et BAP, benzylaminopurine) respectivement pour la sélection et l'organogenèse des feuilles pendant 2 semaines chacun. Le second milieu est moins sélectif que le premier pour alléger la sélection et laisser pousser les plantules en régénération. Les plantules régénérées sont transférées vers un troisième milieu plus sélectif et de même composition que le précèdent pour la sélection finale des plantules transformées. Cette étape permet d’éliminer les événements dits « échappés » (les plantes qui survivent à la sélection mais ne sont pas transformées). Après 2 semaines, les plantules survivantes sont transférées dans un quatrième milieu sélectif enrichi en mannose et en hormones végétale de synthèse pour l'organogenèse des racines.
Criblage PCR et culture en serre S2
Une fois que les plantules ont développé des racines et des feuilles dans le dernier milieu de sélection, chacune d’elles est transférée individuellement dans de petits pots avec un sol de germination et placée dans une armoire d’acclimatation pendant 1 à 2 semaines avec un cycle circadien de 16h/8h avec 22°C/18°C et 60% d’humidité (Figure 38). Elles sont ensuite systématiquement soumises à une période de 2 mois à 6°C pour réaliser la vernalisation et synchroniser la floraison. Les plantules sont sujettes au dessèchement lors des premiers jours d’acclimatation. Le prélèvement de feuilles pour l'extraction d'ADN est effectué une fois que de nouvelles feuilles apparaissent, c'est-à-dire environ 1 à 2 semaines d'acclimatation ou après la période de vernalisation suivant la quantité de feuilles disponible.
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Figure 39 : Culture en serre OGM : a : Après 2 semaines dans la chambre d'acclimatation et 2 mois de vernalisation, les plantes transgéniques T0 (positives en PCR) sont transférées en serre OGM dans des pots de 4 L avec un terreau de culture. b : Floraison des plantes transgéniques T0. c: Chaque épi est isolé dans un sac en plastique perméable à l'humidité pour une autopollinisation. d : Épis transgéniques T0 entièrement fertiles prêt à être récoltés.
a
b
c
150 L'ADN de chaque plante transgénique est extrait à partir de 20 à 100 mg de jeune feuilles à l'aide du système d'extraction d'ADN automatisé Oktopure et du kit d'extraction d'ADN de plante Sbeadex™ (LGC Limited©). Les plantes transgéniques ont été détectées par PCR en utilisant des amorces spécifiques pour les fragments d'ADN insérés et le protocole Amplitaq Gold® 360 Master Mix (Applied Biosystems ™). La transformation a été évaluée par PCR sur transgène grâce à des amorces spécifiques avec, si possible, trois échantillons de feuilles provenant de trois tiges différentes de la même plante. Pour éviter les chimères, les plantes ont été considérées comme transformées lorsque tous les échantillons de la même plante sont positifs à la PCR. Des amorces microsatellites spécifiques ont été utilisées sur chaque échantillon (WMS257, Annexe 3) en tant que contrôle PCR. Les séquences et températures de fusion de toutes les amorces utilisées sont spécifiées en Annexe 3.
Chaque PCR est réalisée à partir de 2µL d’ADN à 10ng/µL. 5µL du mix Amplitaq Gold® 360 Master Mix (Applied Biosystems ™) sont ensuite rajoutés avec 1µL de GC enhancer (fournis dans le kit) et 0.25µL de chacune des amorces à 10nM (0.4uM final). Enfin, le volume de réaction est ajusté à 10µL avec de l’eau up autoclavée. Le programme PCR utilisé est indiqué en Table 5. Les plantules sélectionnées sont transférées individuellement dans des pots de 4 L et placées dans une serre dédiée aux OGM, avec un cycle circadien de 16h/8h avec une température respective de 22°C/18°C. On laisse les plantules pousser jusqu'à maturation des grains pour les étapes suivantes (Figure 39).
Récolte des grains T1
Les grains sont récoltés 2 mois suivant la floraison pour s’assurer de la complète maturation de ceux-ci. Chaque épi est coupé et placé dans une petite batteuse de paillasse pour désolidariser les
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Figure 40 : Stratégie de génotypage des population T1. Chaque cible est encadrée par des marqueurs distants polymorphe entre les deux parents, Chinese Spring et Courtot.
Table 5 : Programme PCR pour le criblage des transgènes
Température (°C) Temps Nombre de cycle Etape
95 10min 1 Dénaturation 95 TM des amorces 72 30sec 30sec 60sec/kb 35 Dénaturation Hybridation Elongation
72 5min 1 Fin de l’élongation
152 grains de l’épi. Les grains récoltés sont placés dans des sachets hermétiques en plastique et placés dans une enceinte spéciale pour la conservation des grains, avec une température constante de 7°C et une humidité inférieur à 30%. Ils y restent minimum une semaine afin de lever la dormance des grains, qui se serait installée à la fin de la maturation. Une fois la dormance levée, les grains sont semés en plaque de culture de 96 puits et laissés pousser une semaine afin de pouvoir récolter les feuilles pour extraction ADN selon le protocole décrit au chapitre 3.7.4.