Les constructions ont été élaborées suivant le protocole de clonage Gateway™ à trois entrées de Invitrogen™ (Figure 33). Ce système fait appel à la recombinaison homologue entre de courtes séquences ADN flanquant les différentes parties que l’on souhaite mettre bout à bout, appelées par la suite « entrées ». L’entrée 1 est le promoteur, l’entrée 2 est le domaine de liaison à l’ADN (TALE ou CRISPR) et l’entrée 3 est la séquence du gène Spo11-1 ou Spo11-2.
Construction des vecteurs plasmidiques
L’entrée numéro un consiste en la séquence du promoteur du gène codant pour l’Ubiquitine de maïs inséré dans un plasmide pDONR P4-P1R™. Ce promoteur a déjà démontré son efficacité au laboratoire et dans la littérature (260). Par ailleurs, la définition des bornes des promoteurs endogènes des gènes Spo11-1 et Spo11-2 de blé n’a jamais été faite et leur efficacité n’a jamais été prouvée. Pour le domaine de liaison à l’ADN (TALE ou CRISPR), celui-ci a été élaboré à partir des séquences déterminées dans le chapitre précédent. Ces séquences ont été confiées à GeneArt® afin de synthétiser une séquence ADN codant pour la protéine TAL spécifique de chacune des séquences. Ainsi ce sont trois séquences ADN codant pour trois protéines TAL différentes qui ont été synthétisées et clonées chacune dans un vecteur pDONR221™. Ceux-ci correspondent à l’entrée numéro deux du système Gateway™. En ce qui concerne l’entrée 3, les séquences ADN
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Figure 33 : Clonage plasmidique Gateway® à trois entrées. Trois produits PCR flanqués des sites spécifiques
attB ou attBr et trois vecteurs Donneurs (pDONR) sont utilisés dans trois réactions de recombinaison BP distinctes pour générer trois clones d’entrée. Les trois vecteurs d’entrée et un vecteur de destination (pDEST) sont utilisés dans une réaction de recombinaison LR pour créer un vecteur d’expression contenant les trois fragments d’ADN de départ. Multisite Gateway® Pro User Guide, Invitrogen®.
132 codant les gènes Spo11-1 et 2, dans lesquelles les deux premiers introns ont été conservés (Spo11-1 et Spo(Spo11-1(Spo11-1-2) ou non (cSpo(Spo11-1(Spo11-1-(Spo11-1 et cSpo(Spo11-1(Spo11-1-2), ont été synthétisées, accompagnées de la séquence du terminateur de la nopaline synthase 3’NOS et clonées dans un vecteur pDONR P2R-P3™. La séquence 3’NOS est utilisée ici comme un signal de polyadénylation fort, couramment utilisé pour assurer l’arrêt de la transcription des gènes clonés en vecteur plasmidique (260).
Les 3 entrées sont clonées dans un vecteur de destination pDEST R4-R3™ en suivant le protocole du kit Gateway™ LR Clonase™ II Enzyme mix de Invitrogen™ (Figure 28). La réaction se déroule dans un tube de 1,5 mL à température ambiante. Entre 50 et 150 ng de chaque vecteur d’entrée pour un volume total compris entre 1 et 7 µL sont mélangés à 1 µ L du vecteur de destination à une concentration de 150 ng/µ L. Le mélange est ensuite complété avec un tampon TE 1/10 à pH 8,0 pour atteindre un volume de 8 µ L. Le mélange d’enzymes LR Clonase ™ II est décongelé sur glace pendant 2 minutes environ et est ensuite vortexé brièvement deux fois (2 secondes à chaque fois). 2 µL de ce mélange d’enzyme sont ajoutés à la réaction dans le tube de 1,5 mL. La réaction est ensuite vortexée et centrifugée brièvement afin de bien mélanger et de ramener toute la réaction dans le fond du tube. La réaction est incubée toute la nuit à 25°C. Le lendemain, pour stopper la réaction enzymatique, 1 µL de protéinase K est rajouté à celle-ci. Le mélange est vortexé, centrifugé puis incubé à 37°C pendant 10 minutes, pour laisser le temps à la protéinase de bien dégrader la LR Clonase II. Une fois la réaction stoppée, celle-ci peut être stockée à -20°C ou utilisée pour transformer des bactérie E. coli.
Constructions réalisées
Six premiers vecteurs plasmidiques contenant chacun une combinaison entre un des trois domaines TAL de liaison à l’ADN et un des deux gène Spo11 dans lequel n’a été retenu que les deux premiers
134 introns ont été construits selon le protocole mentionné au chapitre précédent : TAL15-Spo11-1, TAL15-Spo11-2, TAL28-Spo11-1, TAL28-Spo11-2, TAL47-Spo11-1 et enfin TAL47-Spo11-2. Les vecteurs contenant le gène Spo11-1 font 9565pb et ceux contenant le gène Spo11-2 font 9552pb. Suite à la découverte du souci d’épissage (voir chapitre 4.2.5), trois autres constructions ont ensuite été réalisées comportant les trois domaines TAL précédemment utilisés, couplés cette fois-ci à l’ADNc du gène Spo11-1 (cSpo11-1) : TAL15-cSPO11-1, TAL28-cSPO11-1 et TAL47-cSPO11-1. Ces constructions ont une taille de 9343pb.
Enfin, six guides CRISPR ont été construits à partir de trois cibles situées dans des régions non recombinantes et de trois cibles situées dans des régions faiblement recombinantes. Tous les guides, chacun sous le contrôle d’un promoteur U6A de blé, ont été mis bout à bout dans une seule et même construction nommée « 6 guides CRISPR ». Deux constructions portant d’une part la séquence codante pour une CAS9 fonctionnelle et d’autre part la CAS9 mutée (dCAS9) couplée à l’ADNc de Spo11-1 ont été réalisées : CAS9 et dCAS9-cSpo11-1. Afin de produire une population de secours, une construction contenant le guide nommé GASR7 ayant été démontrée comme efficace dans la littérature, seule et sous le contrôle du même U6A, a aussi été créée.
Chacune des 11 constructions précédentes (guides CRISPR mis à part) est placée sous le contrôle du promoteur du gène ubiquitine de maïs noté pUBI et ayant déjà montré une bonne efficacité d’expression en transgénèse chez le blé tendre au laboratoire (170, 261). Toutes les constructions réalisées sont spécifiées dans la Table 3 et les cartes correspondantes sont précisées en Annexe 1
Vérification et production des vecteurs plasmidiques
La souche E. coli TOP10 a été utilisée pour la transformation et la multiplication des vecteurs créés par LR suivant le protocole suivant : 2µL de LR sont mélangés à 25µL de TOP10 fraichement
136 décongelés sur glace dans un tube à bouchon à vis de 2mL et laissés sur glace 30 minutes. Un choc de température est réalisé au bain marie à 42°C pendant 30 secondes, puis le mélange est laissé 2 minutes sur la glace. 125µL de milieu SOC sont rajoutés au mélange et le tube est incubé avec agitation 1h à 37°C pour débuter la régénération des bactéries. Ensuite 20 et 130 µL de mélange sont étalés sur deux boites de pétri, contenant du milieu LB agar figé additionné d’antibiotique. Les boites de pétri sont incubées une nuit à 37°C. La Table 4 précise la nature et la concentration de chaque antibiotique en fonction du vecteur plasmidique utilisé.
Une fois les colonies bactériennes développées, entre 5 et 10 colonies sont mises en culture liquide dans 3 mL de milieu LB liquide additionnés d’antibiotique correspondant à la résistance du vecteur, pendant une nuit à 37°C sous agitation. 2mL de culture sont prélevés pour extraction de vecteur plasmidique selon le protocole QIAprep® Spin Miniprep de chez QIAGEN™. La nature du vecteur plasmidique extrait est vérifiée par digestion enzymatique avec l’enzyme HaeIII. La réaction s’effectue dans un tube 1,5 mL dans lequel 10 µL de produit d’extraction sont mélangés à 1,5 µL du tampon NEB2 (correspondant à l’enzyme HaeIII de NEB). Ensuite, 3,4 µL d’eau up autoclavée et 0.1µL de l’enzyme HaeIII à 50u/µ L sont ajoutés à la réaction. La réaction enzymatique est incubée 1h30 à 37°C et séparée sur gel d’agarose 2% TAE 0.5 pendant 4h à 90V. Le profil de digestion enzymatique est ensuite comparé au profil de digestion enzymatique théorique généré in
silico grâce au logiciel Vector NTI. Une colonie présentant le bon profil de digestion enzymatique
est sélectionnée et 100µ L de la culture liquide sont ajoutés dans 125mL de milieu LB liquide additionnés d’antibiotique et incubé à 37°C sous agitation pendant une nuit. L’ADN plasmidique est ensuite extrait selon le protocole QIAGEN Plasmid Midi Kit de QIAGEN™.
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Production de la cassette plasmidique pour la transformation par biolistique.
Afin d’assurer la conservation de l’intégrité de la construction lors du bombardement biolistique, le vecteur plasmidique est digéré de part et d’autre de la construction plasmidique afin de linéariser le plasmide et de retirer la partie bactérienne du plasmide. La digestion est effectuée à partir de 20µg de plasmide. Ceux-ci sont mélangés à 4 µ L du tampon spécifique à l’enzyme de restriction et à 7.5µ L d’enzyme de restriction à 10u/µ L. Enfin le volume est ajusté à 37µ L avec de l’eau up autoclavée. La digestion enzymatique est incubée 2h à 37°C et séparée sur gel d’agarose 0.8% à 70V pendant un temps suffisant pour pouvoir séparer les deux bandes résultant de cette digestion. La bande d’intérêt est purifiée selon le protocole décrit dans Tassy et al. en 2014 (261). Ces cassettes ont été introduites grâce à la transformation par Biolistique dans des embryons hybrides immatures de blé tendre afin de générer des plantes transgéniques T0. Celles-ci ont été cultivées en serre OGM dédiée afin de produire une descendance T1