Extraction du transcriptome

Afin d’être analysés à la plateforme de « Biopuces et séquençage » de l’IGBMC, les échantillons d’ARN doi- vent être extraits des cellules, précipités, purifiés, solubilisés et quantifiés. Etant donné les coûts liés à une analyse transcriptomique, la qualité des échantillons est également vérifiée.

3.6.1.1 Préparation des échantillons

L’extraction des acides ribonucléiques se fait sur les cellules vivantes contrôles (Verre)9 et sélectionnées

selon la séquence (E20-Verre)4 en culture sur des lamelles de verre de 18 mm Ø placées au fond de plaques

de 12 puits. L’extraction à proprement parler des ARN (Figure 3-16) se fait sous hotte à aspiration en raison de la toxicité des produits utilisés. L’ensemble des manipulations doivent se faire avec des gants et des cônes stériles. En effet, l’ARN est sensible aux ribonucléases. Ces ribonucléases sont facilement trouvées à la surface de la peau où elles agissent comme mécanisme de défense contre les infections (Dyer and Rosenberg 2006).

Le milieu de culture des cellules est délicatement retiré tout en veillant à ce que le tapis cellulaire reste humide. Un volume de 250 µL de Trizol® est déposé par puits. Incubé 5 minutes à température ambiante, le Trizol® va induire la lyse des membranes cellulaires et nucléaires. Les acides nucléiques vont alors rendre le Trizol® visqueux. Le contenu de 4 puits est ensuite rassemblé dans un microtube de 2 ml. Ces derniers sont ensuite vigoureusement vortexer.

L’extraction des ARN se fait à l’aide de solution de chloroforme CHCl3. Un volume de 200 µL de CHCl3 est

ajouté par tube. Au bout de 10 minutes de réaction à température ambiante, le contenu de tube est tri- phasique. Au fond, une phase aqueuse correspondant au Trizol®, puis un précipité blanc liée au CHCl3 et

enfin en surface, une phase aqueuse contenant les ARN. Les microtubes sont centrifugés à 12 000 g durant 15 min à 4°C. Cette phase de centrifugation va permettre une séparation optimale des différentes phases et accélérer le phénomène dans les tubes retardés.

Cette phase aqueuse est ensuite transférée, en prenant soin de ne pas prélever du soluté blanc, dans un nouveau tube. Un volume de 500 µL d’isopropanol est ajouté dans chacun des microtubes. Cette étape a pour but de faire précipiter les ARN au fond du tube. L’isopropanol agit durant 5 à 10 minutes à tempéra- ture ambiante. Il est important de ne pas vortexer les solutions obtenues lors de cette étape, les ARN étant relativement fragiles. L’homogénéisation se fait par plusieurs retournements lents des tubes. La précipita- tion des ARN est ensuite accélérée par une centrifugation à 12 000 g à 4°C durant 8 minutes. Le surnageant et l’ensemble de l’isopropanol sont délicatement enlevés en totalité afin d’éviter toute pollution de l’échantillon d’ARN.

Les précipités sont ensuite rincés avec de l’éthanol 75% afin d’éviter toute présence résiduelle de l’agent de précipitation isopropanol. Les échantillons sont une nouvelles fois centrifugés durant 5 minutes à 7 500 g avant d’être conservé une nuit à -20°C. Le lendemain, les ARN sont une nouvelle fois rincés à l’éthanol 75% avant de passer par l’étape de solubilisation. Dans le cadre de cette étape, la solution d’éthanol présent dans les tubes à l’issue de ce nouveau rinçage est retirée à l’aide d’une P1000 et d’une P200. Les culots

d’ARN sont mis à sécher à l’air libre durant 5 minutes. Le fragile culot est ensuite délicatement repris dans 50 µL d’eau ultra-pure milliQ autoclavée. La dissolution se fait lentement. Durant ces étapes de solubilisa- tion, les microtubes sont placés dans de la glace. La concentration idéale des ARN est 1 ng/mL. Les échantil- lons obtenus seront quantifiés par spectrophotométrie et le volume d’eau ultra-pure milli-Q ajouté sera adapté aux concentrations mesurées.

Figure 3-16|Schéma récapitulatif du protocole d’extraction des ARN. Les cellules sont lysées par le Trizol®. L’utilisation de chloro-

forme permet de séparer l’ARN des différents composés issus de la lyse cellulaire, les ARN messagers sont précipités à l’aide d’isopropanol puis rincer à l’aide d’éthanol avant d’être remis en suspension dans de l’eau stérile.

3.6.1.2 Quantification des échantillons

La quantification des échantillons d’ARN s’est fait par spectrophotométrie UV. La spectrophotométrie est une méthode de quantification reposant sur l’absorbance de certaines longueurs d’ondes par des molé- cules en solution. Les acides nucléiques (ADN & ARN) ont un pic d’absorbance dans l’UV. Due à la faible quantité d’ARN disponible, un spectrophotomètre adapté à la taille des échantillons a été utilisé, le Nano- Drop®.

3.6.1.2.1 Principe de spectrophotométrie

La spectrophotométrie repose sur le fait que lorsqu’une solution est traversée par une lumière d’intensité

I0, une partie de cette dernière est absorbée par les molécules en solution (Figure 3-17). La lumière ayant

traversé la solution (appelée lumière transmise) I est donc inférieure à l’intensité lumineuse I0.

L’absorbance est donc la résultante du ratio I0/I. Elle est donnée par la formule suivante :

𝐴 = log (𝐼0 𝐼)

Le principe de mesure utilisé par les spectrophotomètres repose sur la relation de Beer-Lambert. Cette relation stipule que pour une longueur d’onde donnée λ, l’absorption est proportionnelle à la concentra- tion d’une solution et à la longueur du trajet optique. Cette relation est la suivante :

𝐴_𝜆= 𝜀_𝜆 l c

Avec Aλ, l’absorbance d’une molécule à une longueur d’onde donnée (sans unité), ελ, le coefficient

d’extinction molaire de la molécule absorbante (en m3_{/mol/cm), l la longueur du trajet optique et finale-}

Figure 3-17|Principe de spectrophotométrie. La spectrophotométrie repose sur le fait que lorsqu’une solution est traversée par

une lumière d’intensité I0, une partie de cette dernière est absorbée par les molécules en solution ; la lumière transmise I est donc

inférieure à l’intensité lumineuse I0. L’absorbance est donc la résultante du ratio I0/I. une longueur d’onde donnée λ, l’absorption

est proportionnelle à la concentration d’une solution et à la longueur du trajet optique. Plus une solution est concentrée, plus l’absorption sera élevée. Adaptée de Servier Medical Art.

3.6.1.2.2 Utilisation du NanoDrop

La densité optique des ARN est mesurée à l’aide d’un NanoDrop (Thermo Fisher). Les acides nucléiques ont une absorbance maximale à 260 nm. La concentration est déterminée par spectrophotométrie d’une goutte de 1 µL de solution. Le blanc a été réalisé à l’aide d’une goutte d’eau ultra-pure milli-Q stérilisée. Le support est au préalable nettoyé et désinfecté avec une solution d’éthanol à 75%. Les longueurs d’onde maximale des acides nucléiques et des protéines sont respectivement de 260 nm et 280 nm. Le ratio 260/280 permet de définir la pureté de la solution d’ARN. Lorsque ce ratio est proche de 1,8, la solution est une solution d’ADN pure. Dans le cas de solution d’ARN pure, ce ratio approche 2. Un autre ratio est éga- lement observé. Ce ratio 230/260 permet de mettre en évidence la présence d’autres contaminants (liés au processus d’extraction comme des restes de Triazol® ou d’éthanol). Un ratio compris entre 2 et 2,2 est signe de pureté de l’échantillon (Figure 3-18)

Figure 3-18|Vue schématique de la courbe d’absorption idéale des acides nucléiques obtenue et réalisée à l’aide du NanoDrop.

L’absorption des acides nucléiques à un pic maximal pour la longueur d’onde 260 nm. Deux autres valeurs sont également obser- vées à 280 nm (pic maximal d’absorption des protéines) et 230 nm (pic maximal des solvants utilisés dans l’extraction des ARN). Les ratios obtenus à partir de ces valeurs sont utilisés comme indice de pureté des échantillons (a.). Exemple de spectrophotomètre NanoDrop (Thermo Fisher) utilisé pour la quantification des échantillons (b.).