Extraction de la CLD et de ses métabolites dans le sérum, le tissu gras, la bile et les organes des animaux

i. Extraction de la CLD et de ses métabolites dans le sérum

Concernant le dosage de la CLD et de ses métabolites dans le sérum, comme indiqué dans la bibliogra-phie, deux méthodes de dosages sensibles et validées permettent de l’effectuer : la méthode du CART présentée dans Fournier et al. (2017) et la méthode de Bichon et al. (2015). Cependant, ces méthodes ne permettent pas d’analyser les métabolites de la CLD. Par conséquent, la méthode développée et va-lidée dans la matrice urinaire pour le dosage de la CLD et de ses métabolites (présentée dans l’article 2) a été appliquée pour la recherche des métabolites dans le sérum. Cependant, afin d’effectuer les dosages dans le sérum, quelques modifications à la méthode dans les urines ont été effectuées étant donné que le sérum contient un haut pourcentage de protéines. La méthode finalement développée pour ces travaux est présentée dans les paragraphes suivants.

2 mL de sérum ont été prélevés et 2 mL d’eau ont été additionnés à la matrice. Chacune des prises d’essai de sérum a été faite en double à l’aide de deux tubes notés 1 et 2. Par la suite 50 µL de 13C-CLD et 50 µL de 13C-CLDOH respectivement à 500 ng mL-1 ont été ajoutés à chacune des prises d’essai.

• Etape de déconjugaison des échantillons

L’étape de déconjugaison dans le sérum a été effectuée comme indiqué dans la partie 2.5 Deconjugaison step de la partie Matériels et Méthodes de l’article 2.

• Etape d’extraction

A l’issue des traitements, 10 mL d’ACN sont ajoutés à chacun des tubes. L’ensemble matrice et ACN est ensuite agité au vortex pendant 1 minute puis mis à centrifuger pendant 5 minutes à 4000 rpm. Cette étape permet de faire précipiter les protéines sanguines. Par la suite, le surnageant est récupéré et 4,0 g de sulfate de magnésium (MgSO4) et 1,0 g de chlorure de sodium (NaCl) sont ensuite ajoutés à chacun des tubes. Les tubes sont ensuite agités au vortex 1 minute puis mis à centrifuger pendant 5 minutes à 4000 rpm. Après centrifugation, les surnageants des tubes 1 et 2 sont évaporés et repris dans 1 mL d’ACN avant analyse par LC-MS/MS à l’aide de la méthode développée dans ces travaux pour le dosage simultané de la CLD et du CLDOH.

ii. Extraction de la chlordécone et du chlordécol dans le tissu gras

0.3 g de tissus gras sont pesés et fondus à 50°C au bain marie. Par la suite 50 µL de 13C-CLD et 50 µL de 13C-CLDOH respectivement à 5 µg mL-1 ont été respectivement ajoutés à la prise d’essai. 5 mL d’un mélange acétonitrile/dichlorométhane (v/v, 75/25) est ensuite ajouté au tube et l’ensemble est agité au vortex pendant 1 minute. Par la suite, l’ensemble est centrifugé à -20°C à 3000 rpm pendant 20 minutes. Le surnageant issu de l’extraction est recueilli dans un second tube et l’étape d’extraction à l’ACN sur le tissu gras restante est effectuée une seconde fois. A l’issue des deux extractions successives, 4 mL du surnageant ACN est ajouté sur une phase dispersive de type PSA/C18 (900 mg MgSO4, 150 mg PSA,

150 mg C18). Le mélange est agité au vortex pendant 1 minute puis mis à centrifuger 5 min à 4000 rpm. Le surnageant issu de la centrifugation est ensuite analysé par LC-MS/MS à l’aide de la méthode déve-loppée dans ces travaux pour le dosage simultané de la CLD et du CLDOH.

iii. Extraction de la chlordécone et de ses métabolites dans les organes et la bile

0,3 g d’organes sont pesés et mis à agiter pendant 1h (Intelli-Mixer) à l’aide de 4,7 mL d’eau MilliQ permettant de réhydrater les échantillons. 2 mL de bile ont été prélevés et 2 mL d’eau ont été additionnés à la matrice. Chacune des prises d’essais d’organes ou de bile a été faite en double à l’aide de deux tubes notés 1 et 2. Par la suite 50 µL de 13C-CLD et 50 µL de 13C-CLDOH respectivement à 5 µg mL-1 ont été ajoutés à chacune des prises d’essai.

• Etape de déconjugaison des échantillons

A l’aide de la première prise d’essai de chacun des doubles entre 10 et 20 µL d’acide acétique 4 M ont été additionnés aux biles et entre 30 et 50 µL d’acide acétique 4 M ont été additionnés aux organes afin que le pH des matrices se situent entre 4,5 et 5,0. Par la suite, afin de tamponner les matrices, 4 et 5 mL de tampon acétate (0.2 M, pH = 4.75) ont été respectivement additionnés aux biles et aux organes. Enfin 100 µL et 125 µL de Sulfatase type H-2 (≥ 100 unités µL-1 pour l’activité β-glucuronidase et ≥ à 2 unités µL-1 pour l’activité sulfatase) ont été respectivement additionnés aux biles et aux organes. Cette première prise d’essai permettra d’obtenir les concentrations totales de CLD et de CLDOH après l’étape de dé-conjugaison (soit CLD-t et CLDOH-t). A l’aide de la seconde prise d’essai de chacun des doubles, 4 et 5 mL de tampon acétate (0.2 M, pH = 4.75) ont été respectivement additionnés aux biles et aux organes. Cette seconde prise d’essai permettra d’obtenir les concentrations libres de CLD et de CLDOH à l’issue de l’étape de déconjugaison. La soustraction entre les concentrations de CLD-t et de CLD (respective-ment pour le CLDOH) permettra de déterminer les concentrations de métabolites conjugués de la CLD et du CLDOH. A l’issue de ces traitements, les échantillons sont mis à l’étuve à 37°C pendant 16h.

• Etape d’extraction

A l’issue des traitements, 10 mL d’acétonitrile (ACN) sont ajoutés à chacune des prises d’essai. L’en-semble matrice et ACN est ensuite agité au vortex pendant 1 minute. 4,0 g de sulfate de magnésium (MgSO4) et 1,0 g de chlorure de sodium (NaCl) sont ensuite ajoutés et l’ensemble est agité au vortex 1 minute puis mis à centrifuger pendant 5 minutes à 4000 rpm. Après centrifugation, 1 mL du surnageant est déposé sur la phase dispersive PSA/C18/Envi-Carb (50 mg de PSA, 50 mg de C18 et 50 mg d’Envi-Carb). Le mélange est agité au vortex pendant 1 min puis mis à centrifuger 5 minutes à 4000 rpm. Le surnageant issu de la centrifugation est ensuite analysé par LC-MS/MS à l’aide de la méthode dévelop-pée dans ces travaux pour le dosage simultané de la CLD et du CLDOH.

iv. Vérification des performances des méthodes complémentaires de dosage de la chlordécone

Afin d’assurer les valeurs de concentrations obtenues à l’aide des méthodes développées mais non vali-dées dans le sérum, le tissu gras, la bile et les organes pour le dosage de la CLD et de ses métabolites, ce travail s’est appuyé sur l’utilisation des étalons internes 13C-CLD et 13C-CLDOH. Lors des analyses, des contrôles qualités étaient effectués et les taux de récupération obtenus en étalonnage interne se si-tuaient tous entre 70 et 120 %.

Ce travail de développement analytique permet de disposer de méthodes de dosage de la CLD et de ses métabolites dans les différentes matrices d’intérêts pour les études toxicocinétiques. La partie qui suit présentera les travaux effectués concernant les méthodes enzymatiques utiles à la démonstration du mé-tabolisme chez la brebis.

PARTIE 2: Méthodes pour l’identification de la chlordécone réductase et