Validation of analytical methods for chlordecone and its metabolites in the urine and feces of ewes
4. Analyse des données
i. Données sériques
L’analyse des données sanguines du protocole 1 est précisée dans la partie 1.4 du manuscrit de l’article 3 qui suit « Linear toxicokinetic of chlordecone in ewe’s serum ».
L’analyse des données sanguines du protocole 2 a été réalisée à l’aide du logiciel R Core team, 2017. Afin de déterminer les paramètres toxicocinétiques du chlordécol, un modèle monocompartimental a été appliqué (Equation 1). En effet, le chlordécol semble se distribuer rapidement dans l’organisme ani-mal et il n’a donc pas été possible de déterminer le temps de demi-vie de distribution du chlordécol à l’aide de ces travaux.
Eq (1) C (t) = Co𝑒−K10𝑡
Avec C(t) (ng mL-1) représentant la concentration sérique de CLD au temps t, Co (ng mL-1), la concen-tration extrapolée au temps t = 0 et K10 (h-1), la constante d’élimination de premier ordre du chlordécol dans le sang. A l’aide de ce modèle, il a été possible de calculer les paramètres toxicocinétiques du chlordécol.
L’aire sous la courbe du temps (𝐴𝑈𝐶0→∞ ) t=0 au temps t = ∞, a été calculée à l’aide de l’équation 2 ci-dessous :
Eq (2) 𝐴𝑈𝐶0→∞= Co/K10
Le temps de demi-vie d’élimination du chlordécol (t1/2β elim) a été calculé à l’aide de l’équation 3 ci-dessous :
Eq (3) t1/2β elim= ln (2)/ K10
La clairance sérique totale (Cltot) a été obtenue à l’aide de l’équation 4 : Eq (4) Cltot = Dose/𝐴𝑈𝐶0→∞
Enfin, le volume de distribution (Vc) a été obtenu à l’aide de l’équation 5 : Eq (5) Vc = Cltot / K10
Chacun des paramètres a été calculé individuellement pour chacune des brebis (n=3). A l’aide de ces paramètres individuels, il a été possible de déterminer la moyenne et l’écart-type de la moyenne pour chacun des paramètres calculés. Afin de comparer les paramètres toxicocinétiques du CLD et du CLDOH, un test de Student a été effectué en considérant la brebis comme une unité expérimentale. Une différence est significative entre deux paramètres lorsque la p-value retrouvée est inférieure à 0,05.
ii. Données urinaires et fécales
L’analyse des données fécales a permis de déterminer le pourcentage de la dose administrée de CLD ou de CLDOH éliminé via les fèces pour chacune des brebis. Concernant les données urinaires, il n’a pas été possible de déterminer ces pourcentages à cause de difficultés de prélèvement. Le pourcentage de la dose excrété de la molécule via les fèces est déterminé à l’aide du rapport entre la clairance fécale et la clairance sérique de la molécule (compartiment de référence). La clairance exprime la capacité d'un organe (ou de l'organisme) à éliminer un analyte (Toutain and Bousquet-Melou, 2007a). L’équation 6 permet de résumer le calcul de pourcentage de molécules excrétées respectivement via les fèces.
Eq (6) % 𝑑𝑜𝑠𝑒 𝑒𝑥𝑐𝑟é𝑡é 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑜𝑙é𝑐𝑢𝑙𝑒 𝑣𝑖𝑎 𝑙𝑒𝑠 𝑓è𝑐𝑒𝑠 = 𝐶𝑙𝑓é𝑐𝑎𝑙𝑒 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑜𝑙é𝑐𝑢𝑙𝑒
𝐶𝑙𝑠é𝑟𝑖𝑞𝑢𝑒 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑜𝑙é𝑐𝑢𝑙𝑒
La détermination de la clairance fécale est possible à l’aide d’une constante de proportionalité reliant la vitesse d’élimination de la molécule (i.e l’évolution des quantités excrétées de la molécule dans les fèces sur un intervalle de temps donné) à une concentration sanguine donnée (i.e la concentration de la
molécule dans le sérum au temps moyen de l’intervalle du prélèvement fécal). L’équation permettant de déterminer la clairance est présentée par l’équation 7.
Eq (7) 𝑑𝑄𝑚𝑜𝑙é𝑐𝑢𝑙𝑒𝑒𝑥𝑐𝑟é𝑡é𝑒𝑠 𝑣𝑖𝑎 𝑙𝑒𝑠 𝑓è𝑐𝑒𝑠𝑑𝑇
= 𝐶𝑙
𝑓é𝑐𝑎𝑙𝑒 ∗ [molécule] sériqueAvec 𝑑𝑄𝑚𝑜𝑙é𝑐𝑢𝑙𝑒𝑑𝑇𝑒𝑥𝑐𝑟é𝑡é𝑒𝑠
(ng h
-1)
: le taux d’excrétion fécal;
[molécule] sérique (ng mL-1) : la concentra-tion de la molécule dans le sérum correspondante au temps moyen de l’intervalle du prélèvement fécal;
et
𝐶𝑙
𝑓é𝑐𝑎𝑙𝑒(mL h
-1) :
la clairance fécale• Calculs des pourcentages de CLD et de CLDOH excrétés après i.v de CLD
Pour chacune des brebis et après administration de CLD, l’évolution des quantités excrétées de CLD dans les fèces a été tracée en fonction des concentrations de la molécule dans le sérum.
La relation obtenue pour la détermination de la clairance fécale de la CLD était linéaire et celle-ci est résumée à l’aide de l’équation 8 :
Eq (8) 𝑑𝑄𝐶𝐿𝐷𝑑𝑇𝑓é𝑐𝑎𝑙𝑒
= 𝐶𝑙
𝑓é𝑐𝑎𝑙𝑒 ∗ [CLD] sériqueAvec 𝑑𝑄𝐶𝐿𝐷 𝑑𝑇𝑓é𝑐𝑎𝑙𝑒
(ng h
-1)
représentant le taux d’excrétion fécal de la CLD, [CLD] sérique (ng mL-1) : la concentration de la CLD dans le sérum correspondant au temps moyen de l’intervalle de prélèvement fécaleet𝐶𝑙
𝑓é𝑐𝑎𝑙𝑒(mL h
-1) :
la clairance fécale de la CLD.Pour chacune des 5 brebis du protocole 1, les clairances fécales de la CLD ont été déterminées. Puis une valeur moyenne et un écart type de la moyenne ont été calculés à partir de ces données individuelles. A l’aide du ratio entre la moyenne des clairances fécales et sériques de la CLD, il a été possible de déter-miner le pourcentage de CLD éliminé dans les fèces après administration de CLD.
Pour chacune des brebis et après administration de CLD, l’évolution des quantités excrétées de CLDOH-t dans les fèces a éCLDOH-té CLDOH-tracée en foncCLDOH-tion des concenCLDOH-traCLDOH-tions de la molécule dans le sérum.
Après administration de CLD, la relation obtenue pour la détermination de la clairance fécale du CLDOH-t était linéaire et celle-ci est résumée à l’aide de l’équation 9 :
Eq (9) 𝑑𝑄𝐶𝐿𝐷𝑂𝐻−𝑡𝑓é𝑐𝑎𝑙𝑒
𝑑𝑇
= = 𝐶𝑙
𝑓é𝑐𝑎𝑙𝑒 ∗ [CLDOH-t] sériqueAvec 𝑑𝑄𝐶𝐿𝐷𝑂𝐻−𝑡 𝑑𝑇 𝑓é𝑐𝑎𝑙𝑒
(ng h
-1)
représentant le taux d’excrétion fécal du CLDOH-t, [CLDOH-t] sé-rique (ng mL-1) : la concentration de CLDOH-t dans le sérum correspondant au temps moyen de l’inter-valle de prélèvement fécaleet𝐶𝑙
𝑓é𝑐𝑎𝑙𝑒(mL h
-1) :
la clairance fécale du CLDOH-t.Pour chacune des 5 brebis du protocole 1, les clairances fécales du CLDOH-t ont été déterminées. Puis une valeur moyenne et un écart type de la moyenne ont été calculés à partir de ces données individuelles.
Concernant le CLDOH, le calcul du pourcentage de CLDOH éliminé dans les fèces après administration de CLDOH a été effectué comme indiqué par l’équation 10 :
Eq (10)
% 𝑑𝑒 𝐶𝐿𝐷𝑂𝐻 é𝑙𝑖𝑚𝑖𝑛é 𝑑𝑎𝑛𝑠 𝑙𝑒𝑠 𝑓è𝑐𝑒𝑠 𝑎𝑝𝑟è𝑠 𝑖. 𝑣 𝑑𝑒 𝐶𝐿𝐷 = P x
𝐶𝑙𝑓é𝑐𝑎𝑙𝑒 𝐶𝐿𝐷𝑂𝐻−𝑡𝐶𝑙𝑠é𝑟𝑖𝑞𝑢𝑒 𝐶𝐿𝐷𝑂𝐻−𝑡
Avec
P
représentant la part restante de CLD à éliminer et calculée en faisant la différence entre 1 et la part de CLD éliminée dans les fèces ;𝐶𝑙
𝑓é𝑐𝑎𝑙𝑒 𝐶𝐿𝐷𝑂𝐻−𝑡(mL h
-1) :
la clairance fécale du CLDOH-t et𝐶𝑙
𝑠é𝑟𝑖𝑞𝑢𝑒 𝐶𝐿𝐷𝑂𝐻−𝑡(mL h
-1) :
la clairance sérique du CLDOH-t. L’hypothèse permettant d’effectuer lecalcul du pourcentage de CLDOH éliminé dans les fèces après i.v de CLD est que la CLD s’elimine exclusivement sous deux formes dans les fèces à savoir sous forme de CLD et de CLDOH.
• Calculs du pourcentage de CLDOH excrétés après i.v de CLDOH
Après administration de CLDOH, la relation obtenue pour la détermination de la clairance fécale était de type Michaelis-Menten et est résumée à l’aide de l’équation 11 (Toutain and Bousquet-Melou, 2007a) :
Eq (11)𝑑𝑄𝐶𝐿𝐷𝑂𝐻−𝑡𝑑𝑇 𝑓è𝑐𝑒𝑠 = 𝐾 𝑉𝑚𝑎𝑥
𝑀+[𝐶𝐿𝐷𝑂𝐻−𝑡]𝑠é𝑟𝑖𝑞𝑢𝑒 [𝐶𝐿𝐷𝑂𝐻 − 𝑡]𝑠é𝑟𝑖𝑞𝑢𝑒
Avec 𝑑𝑄𝐶𝐿𝐷𝑂𝐻−𝑡𝑑𝑇 𝑓è𝑐𝑒𝑠
(ng h
-1)
représentant le taux d’excrétion fécale du CLDOH-t, Vmax(ng h
-1)
la capacité maximale du système à éliminer la molécule et KM (ng mL-1) la concentration correspondant à Vmax/2.Le KM est une mesure de l’affinité de la molécule pour le système d’élimination (par exemple une en-zyme)
Pour chacune des 3 brebis du protocole 2, l’évolution du taux d’excrétion fécale du CLDOH-t en fonc-tion de la concentrafonc-tion sérique de CLDOH-t. Après détermination des valeurs de Vmax et KM à l’aide du logiciel R Core team, 2017, les clairances fécales pour chacune des brebis ont été déterminées comme précisé par l’équation 12 et en faisant l’approximation que la valeur du KM est très élevée par rapport à la valeur de concentration sérique de CLDOH-t et donc en fait en négligeant la concentration sérique :
Eq (12) Cl fécale CLDOH-t = Vmax/KM
Finalement, une valeur moyenne et un écart type de la moyenne ont été calculés à partir de ces données individuelles. A l’aide du ratio entre la moyenne des clairances fécales et sériques du CLDOH-t, il a été possible de déterminer le pourcentage de CLDOH éliminé dans les fèces après administration de CLDOH.