Expression de la protéase HtrA1

L’expression de HtrA1 a été mesurée directement sur les tissus tumoraux des patientes. Pour chaque patiente, trois échantillons de la tumeur ont été sélectionnés. Ces derniers ont permis de réaliser une matrice tissulaire (tissue microarray, TMA). Deux séries de TMA ont été construits : une pour l’évaluation des tissus tumoraux et une pour la lecture de stroma néoplasique. Ce deuxième TMA a été construit par moi-même. Chaque TMA est ensuite traité en immunohistochimie. Finalement, la lecture de l’expression de HtrA1 a été faite par une lecture visuelle et une lecture informatisée.

2.3.1 Construction des Tissue Micro Arrays

Pour la conservation, les tissus tumoraux des patientes ont été fixés en formaline tamponnée puis enrobés en paraffine afin de former des blocs. Un bloc de tissu par patiente a été sélectionné. Les blocs et les zones à prélever ont été choisis préalablement par un pathologiste pour leur représentativité de toute la tumeur. Trois échantillons de tissus (0,6 mm de diamètre) y ont été prélevés et ont été insérés dans un bloc de paraffine vierge à l’aide d’un tissue arrayer (Beecher Instruments) pour former les TMA. Les tissus des patientes ont été placés de manière aléatoire sur les blocs vierges afin d’éviter tout risque de biais lors de la lecture.

2.3.2 Réalisation des immunohistochimies

Des lames ont été confectionnées à partir de coupes de 4 μm de chacun des TMA, ainsi que de deux coupes d’un témoin positif de tissu de tumeur de l’ovaire dont la réactivité à l’anticorps HtrA1 est connue. Les lames sont ensuite traitées en immunohistochimie selon la méthode avidine-biotine. Les tissus ont été déparaffinés dans le toluène et réhydratés dans des gradients d’éthanol décroissants. Le démasquage des épitopes antigéniques a été réalisé à chaud dans un tampon citrate pH6, suivi d’un blocage des peroxydases endogènes par une incubation de 5 minutes avec du peroxyde d’hydrogène 3%. Les lames ont été ensuite traitées avec la trousse de blocage de la biotine endogène Biotin Blocking System de DAKO (#cat : X0590) pour limiter la réactivité non spécifique à l’anticorps HtrA1. Puis, un sérum bloquant a été appliqué durant 20 minutes à température ambiante pour neutraliser les sites non spécifiques. Toutes les lames, sauf celle du témoin négatif, ont été incubées avec l’anticorps polyclonal primaire de lapin anti-Htra1 N-term (ab38611, ABCAM) à une dilution de 1/75 à température ambiante pendant une heure. Le témoin négatif a été traité avec le diluant à anticorps seul. L’anticorps secondaire biotinylé et le réactif avidine-HRP de la trousse Super Stain HRP kit (cat# IDST1007, IDLabs, London, ON, Canada) ont été appliqués successivement durant 20 minutes pour la détection de l’anticorps primaire. Une incubation de 5 minutes avec le chromogène 3,3’diaminobenzidine (DAB chromogen #catBP1111, IDLabs, London, ON, Canada) a permis la visualisation des sites marqués par HtrA1. Les lames ont été contre-colorées à l’hématoxyline de Harris (Fisher Scientific #cat SH26-500D) afin de mieux visualiser les structures cellulaires, puis déshydratées dans l’éthanol, éclaircies dans le xylène et montées avec une lamelle dans un milieu permanent.

Tableau 6 : Résumé du protocole d’immunohistochimie

Informations sur l’anticorps Protocole

Nom Anticorps correspondant Compagnie # de catalogue Dilution en IHC Temps d’incubation Démasquage antigénique Blocage biotine endogène Htra-1 N- Term Anti-htra-1 N- Term

2.3.3 Validation de la spécificité de l’anticorps utilisé pour les immunohistochimies

La spécificité de l’anticorps pour HtrA1 a été testée dans différentes lignées de cancer de l’ovaire de différents types histologiques (TOV81D, OV90, TOV112D, TOV1946, TOV2223G) et une lignée d’adénocarcinome du sein (MCF7). Un PCR et un Western blot ont ensuite été faits. La bande la plus importante correspondant au poids moléculaire de la forme native de HtrA1, soit environ 50 kDa, a bien été identifiée.

2.3.4 Lecture des immunohistochimies

Tel que mentionné, des études ont indiqué que HtrA1 est sécrétée dans le cytoplasme et dans l’espace extracellulaire, mais sa présence a aussi été trouvée dans le noyau(52, 60, 61). Aucune étude ne mentionne le marquage du stroma, sauf les travaux préliminaires menés par notre équipe(75). Comme aucun marquage dans l’espace extracellulaire n’a été observé avec nos TMA, le marquage a été évalué, lors des lectures visuelle et informatisée, au sein de la tumeur dans deux structures cellulaires : le cytoplasme et le noyau. Le marquage a aussi été évalué dans les noyaux du stroma. Deux mesures ont été prises lors de la lecture : le pourcentage de cellules marquées et l’intensité du marquage. L’intensité du marquage a été évaluée sur une échelle de 0 à 3, où 0 représente l’absence de marquage et 3, un marquage maximal (voir figures 2 et 3).

Figure 2 : Échelle de l’intensité du marquage dans les noyaux tumoraux.

L’image en haut à gauche illustre un marquage négatif et à droite, un marquage nucléaire de 1. En bas à gauche, le marquage est équivalent à 2 et à droite, l’image représente le marquage maximal de 3.

Figure 3 : Échelle de l’intensité du marquage dans les cytoplasmes tumoraux.

L’image en haut à gauche illustre un marquage négatif et à droite, un marquage nucléaire de 1. En bas à gauche, le marquage est équivalent à 2 et à droite, l’image représente le marquage maximal de 3.

Figure 4 : Échelle de l’intensité du marquage dans les noyaux du stroma.

L’image en haut à gauche illustre un marquage nucléaire négatif et à droite, un marquage nucléaire de 1. En bas à gauche, le marquage est équivalent à 2 et à droite, l’image représente le marquage maximal de 3

2.3.4.1 Lecture visuelle

Toutes les matrices tissulaires ont été numérisées avec un scanneur de lames (NanoZoomer 2.0-HT, Hamamatsu, Bridgewater, NJ, USA) à un grossissement de 20X et stockées sur un serveur (mScope, Aurora Interactive, Montréal, Canada) pour la lecture visuelle du marquage de HtrA1. Pour être considérées dans l’étude, la surface de l’échantillon devait être composée à plus de 30% de tumeur ou de stroma et les patientes devaient avoir au moins deux échantillons évaluables. Toutes les mesures immunohistochimiques ont été réalisées par moi-même et ont été révisées par une pathologiste, toutes deux en aveugle. Les résultats divergents entre les deux évaluations étaient revus par un pathologiste sénior.

2.3.4.2 Lecture informatisée

Selon Riber-Hansen et al., l’analyse d’image informatisée en histopathologie concerne « le processus qui permet d’obtenir une image informatisée à partir d’un microscope connecté à une caméra digitale ou encore d’un numériseur de lames pour y mener une analyse informatisée afin d’extraire l’information désirée des images »(93). Par rapport à la lecture traditionnelle en histopathologie, la lecture informatisée permettrait d’obtenir une meilleure reproductibilité des résultats, de parvenir à un gain de temps, d’éliminer la subjectivité des analyses par un pathologiste et, par conséquent, de diminuer la variabilité intra- et inter-lecteurs, ainsi que de produire des mesures quantitatives et donc des variables continues(93, 94). La mise au point d’un algorithme de lecture varie selon le logiciel utilisé, mais il doit être comparé au test de référence qui demeure la lecture visuelle par le pathologiste.

L’algorithme de lecture informatisée a été mis au point par moi-même avec le logiciel Calopix (Tribvn, Châtillon, France) seulement pour les images tumorales. La technique d’analyse permet d’abord la segmentation des différentes structures trouvées dans les échantillons : sélection des zones tumorales et rejet des tissus non tumoraux. Ensuite, la segmentation des noyaux et des cytoplasmes est réalisée. L’intensité de HtrA1 est mesurée dans les zones nucléaires et cytoplasmiques. Deux mesures similaires à la lecture visuelle ont été réalisées soit le pourcentage de pixels marqués en brun en immunohistochimie et l’intensité du marquage.

Segmentation des tissus

Calopix permet la reconnaissance et la segmentation des diverses structures dans les échantillons via l’outil Ilastik. Il fonctionne par la détection des textures créées par les différents niveaux de gris et la détection des bords des objets, c’est-à-dire le brusque changement des niveaux de gris(95). Dans la présente étude, six images ont été sélectionnées pour leur représentativité de l’ensemble des tumeurs comprises sur les TMA.

Comme l’immunomarquage brun de HtrA1 influe directement sur les niveaux de gris, les échantillons qui ont été choisis avaient des patrons d’expression de la protéase les plus variés possible. À partir de ces images, quatre catégories de structures ont été enseignées à Ilastik, soit la tumeur, le stroma, la nécrose et le fond de la lame en sélectionnant des zones représentatives de chaque structure (voir figure 10 en annexe 1).

À partir de l’enseignement décrit précédemment, Ilastik génère un algorithme qui a été utilisé sur tous les autres échantillons et qui a masqué toutes les structures que l’on ne souhaitait pas analyser. Seules les régions tumorales ont été gardées pour l’analyse (figure 11, image 2 à l’annexe 1). La segmentation a été vérifiée visuellement pour chaque échantillon. Les erreurs majeures de segmentation ont été corrigées manuellement.

La reconnaissance des noyaux et des cytoplasmes dans la tumeur s’est fait de la même manière que celle de la tumeur et du stroma. Six images ont été sélectionnées pour l’apprentissage dans Ilastik. Elles ont été choisies pour obtenir une grande variété de marquage : des images de noyaux très marqués et d’autres peu marqués avec des nucléoles très visibles entourés soit d’un cytoplasme très ou peu marqué. Le programme généré par Ilastik a été utilisé sur Calopix sur chacune des images pour segmenter d’abord les noyaux (figure 11, image 3 à l’annexe 1). La segmentation a été refaite pour l’analyse cytoplasmique. Chaque image a été vérifiée manuellement.

Analyse du marquage nucléaire et cytoplasmique tumoral

Calopix analyse les pixels bruns de l’image avec l’outil immuno-object dans les zones non masquées, soit les noyaux et les cytoplasmes tumoraux. Il compte le pourcentage de pixels marqués en brun et classe ces pixels dans les différentes catégories d’intensité de marquage. Les catégories d’intensité de marquage ont été sélectionnées manuellement pour concorder avec les analyses visuelles: 0 (absence de marquage) à 3 (marquage maximal). Les seuils choisis ont été testés sur 25 images et les résultats d’analyse ont été comparés avec les analyses visuelles avant d’être utilisés sur tous les échantillons (figure 11, image 4 à l’annexe 1).