Chapitre II : Matériels et méthodes Table des matières
2. Stratégie d’échantillonnage et sites d’étude 1 Études in situ 1 Études in situ
2.2 Expériences in vitro en laboratoire
Dans le cadre du projet CRAPPSE, différentes études ont été simulées en laboratoire afin d’évaluer la persistance de contaminants organiques retrouvés en estuaire de Seine et d’identifier les produits de dégradation de molécules encore peu ou pas étudiées.
2.2.1 Irradiation solaire dans un réacteur photochimique
a. Descriptif de l’appareillage
Les réactions photochimiques induites par les rayonnements solaires dans le compartiment aquatique ont été simulées grâce à un réacteur photochimique : SUNTEST CPS (Atlas, Illinois, USA). Cet appareil est constitué d’une lampe à arc Xénon et de deux filtres permettant d’éliminer les rayonnements ultraviolets et infrarouges. Le spectre continu de 400 à 600 nm émis est comparable au spectre d’émission du rayonnement solaire naturel (Figure 26). La température de la chambre d’irradiation est maintenue à 25°C et l’intensité d’irradiation a été fixée à 250 W.m-2.
Figure 26 : Comparaison des spectres d’émission du simulateur solaire et du rayonnement solaire naturel en mai à Périgueux (Nassar, 2014).
b. Irradiation d’échantillons naturels non dopés
Une expérimentation exploratroire a été conduite en irradiant artificiellement un effluent de la STEU de Rouen. Le but était d’évaluer de façon globale les molécules les plus réactives au rayonnement solaire. Pour cela un effluent de la STEU de Rouen a été irradié artificiellement pendant 24h. Différents échantillons ont été récoltés à différents temps d’irradiations : T0, T200 min, T400 min et T1440 min (24h).
c. Irradiations d’échantillons artificiellement reconstitués pour l’identification de nouveaux produits de transformation
Ce volet est le résultat d’une approche complémentaire avec des études de réactivité qui ont été menées en parallèle par Montaha Yassine et Aurélien Trivella (UMR EPOC). Un travail d’identification des produits de transformation issus de la photodégradation solaire de 7 molécules a été mené dans le cadre de ces travaux.
Tableau 12 : Récapitulatif des molécules mères étudiées dans les expériences sous irradiation solaire : identification des produits de transformation majoritaires. * danscette étude, [1] (Nakata et al., 2005), [2] (Tamtam et al., 2007), [3] (Iglesias et al., 2014), [4] (Aminot et al., 2015), [5] (Funke et al., 2016), [6] (Vasquez et al., 2013), [7] (Zivanovic et al., 2006), [8] (Zgadzaj et al., 2015), [9] (Hubicka et al., 2013), [10] (Calza et al., 2008), [11] (Hubicka et al., 2014), [12] (Sturini et al., 2012a), [13] (Sturini et al., 2015), [14] (Ge et al., 2015), [15] (Kusari et al., 2009), [16] (Prabhakaran et al., 2009), [17] (Kurmi et al., 2017). (U= usage).
Molécules étudiées Classe pKa Occurrence (ng.L-1)
Etudes de transformation sous irradiation solaire simulée Ofloxacine Antibiotiques fluoroquinolones U. humain 5,9 8,3 Poses : 5-8* Effluent Rouen :115-300* Effluent STEU : 100-510 [1] 5 [6,7, 8,9, 10] Danofloxacine Antibiotiques fluoroquinolones U. vétérinaire 6,4 9,0 Poses : <LQ* Effluent Rouen :<LQ* Eaux de surface : 30 [2] 4 [11, 12, 13, 14] Sarafloxacine Antibiotiques fluoroquinolones U. vétérinaire 6,2 8,7 Poses : <LQ* Effluent Rouen :<LQ*
Eaux de surface (rural) : 171,5 [3]
3 [14, 15, 16] Apixaban NACO U. humain 0,8 15,0 Poses : 0,1-0,9* Effluent Rouen : 1-5 * 0 Dabigatran NACO U. humain 4,2 12,9 Poses : 15-34* Effluent Rouen : 145-510* 0 Rivaroxaban NACO U. humain 1,0 13,4 Poses : 0,7-1,3 * Effluent Rouen :11-21 * 0 Abacavir Anti-rétroviraux U. humain 5,04 15,4 Poses : <LD-59 * Effluent Rouen : <LD-24 * Effluent STEU: 26-33 [4,5] 1 [17]
Au total, sept composés pharmaceutiques provenant de 3 classes thérapeutiques ont été sélectionnés sur différents critères : (1) présence dans l’environnement, (2) toxicité suspectée même à faibles concentrations, (3) molécules dont les données concernant leur photodégradation étaient encore trop rares (Tableau 12). L’identification des produits de transformation a été réalisée à partir d’échantillons d’eaux ultrapures ou minérales artificiellement enrichies en composés. Pour chaque molécule étudiée, trois types d’échantillons ont été récoltés et étudiés :
• Un échantillon non irradié (temps initial ou T0) représentant le témoin.
• Des échantillons irradiés à différents temps : des temps à faible et fort taux de conversion afin de pouvoir discriminer des produits de transformations primaires des secondaires.
• Un échantillon placé dans la chambre d’irradiation mais protégé par un papier aluminium : témoin obscurité. Cet échantillon subit les variations thermiques qu’engendre la chambre d’irradiation.
2.2.2 Étude de la dégradation des contaminants en microcosmes
Le bouchon vaseux ou zone maximale de turbidité est une zone estuarienne présentant un potentiel réactionnel particulier combinant accumulation de matières en suspension et population bactérienne importante. Le rôle accélérateur ou inhibiteur de ce milieu récepteur particulier dans la dégradation des composés présents en sortie de STEU de Rouen a été étudié. Deux incubations in vitro d’eaux estuariennes mélangées à l’effluent de STEU ont été réalisées. Le protocole d’incubation utilisé a déjà été appliqué avec succès lors de précédentes thèses (Aminot, 2013; Lanoux, 2013).
a. Prélèvements des échantillons
Deux types d’eaux estuariennes ont été comparés : Seine et Garonne. En Seine, les concentrations MES varient entre 0.1 et 1 g.L-1 (Lesourd et al., 2016). En Garonne estuarienne, la concentration en MES dépasse fréquemment 1 g.L-1 dans les eaux de surface et peuvent atteindre 10 g.L-1 dans le fond de la colonne d’eau (Etcheber et al., 2007). La quantité et la qualité de MES retrouvés en Seine et en Garonne sont différentes et vont influencer la pénétration de lumière, la composition de la matière organique et la présence et le type de microorganismes.
Environ 80 L de l’effluent de la STEU de Rouen ont été prélevés pour alimenter les différents aquariums. Un échantillon ponctuel a été prélevé manuellement en sortie de traitement dans des flacons de 25 L en polypropylène haute densité. Pour réaliser ces expériences, un prélèvement de 100 L de chaque bouchon vaseux a été nécessaire. Le bouchon vaseux de la Seine a été récolté le 12 Juillet 2015 au niveau du pont de Tancarville
(49°28’30.19’’N ; 0°27’48.64’’). Les échantillons ont été prélevés dans des bouteilles ambrées de 5 L préalablement calcinées. Le bouchon vaseux de la Garonne a été prélevé au niveau de Bègles, le 28 septembre 2015, à mi-jusant, durant un fort coefficient de marée.
Figure 27 : Sites de prélèvement des eaux de bouchon vaseux (en jaune) prélevées en Seine et en Gironde.
b. Préparation préliminaire et description des conditions expérimentales
Les eaux prélevées en Seine et en Garonne ont été dans un premier temps laissées à décanter quelques heures dans le but de récupérer un surnageant et un concentrât afin d’alimenter respectivement les conditions LLS et HSS (Figure 28). Les aquariums MSS, HSAL et HgCl2 ont été préparés avec les concentrations originelles en matières en suspension (MES) des bouchons vaseux prélevés et sans phase de décantation. L’ajout de 100 mg.L-1 de chlorure mercurique dans l’aquarium HgCl2 a permis d’obtenir un contrôle stérile. Cette procédure de stérilisation a déjà été appliquée avec succès dans différents études (Yu et al., 2006). Dans la condition HSAL, du sel marin a été ajouté jusqu’à obtenir une salinité de 5‰.
Figure 28 : Résumé des conditions expérimentales mises en place lors des expériences d’incubation en présence des bouchons vaseux de la Seine et de la Gironde.
c. Dispositif et déroulement de l’expérimentation
L’étude de dégradation en présence de bouchon vaseux a été conduite dans des aquariums en verre de 25 L. L’oxygénation de l’eau est régulée par un bullage d’air en continu et une homogénéisation de la masse d’eau par un système de brassage. L’ensemble de l’expérimentation a été réalisée à l’obscurité et dans une pièce thermostatée à 20°C. Un suivi quotidien de la température (T°C), salinité (Sal), oxygène dissous et du pH, a été réalisé durant les 21 jours d’incubation sans aucun renouvellement d’eau. Des prélèvements d’eau (3 L) ont été effectués 10 min après le mélange initial (T0), et après 7, 14, 17 et 21 jours d’incubation, temps représentatifs des temps de résidence de l’eau dans l’estuaire à des périodes de haut et bas débits. Ces 50 échantillons ont ensuite été répartis en différentes filières analytiques : analyses chimiques ciblées (pharmaceutiques et pesticides) et bioessais in vitro (réalisés par INERIS et TOXEM). Pour compléter les données obtenues, des analyses de la matière organique dissoute (carbone organique dissous et mesures de fluorescence et absorbance UV) ont été conduites à tous les temps prélevées et pour chaque aquarium par Edith Parlanti (EPOC-LPTC).
Figure 29 : Dispositif expérimental schématisé.