L’objectif de cette séquence est d’établir des corrélations hétéronucléaires via la détection inverse pour des couplages à plusieurs liaisons (nJHX) tout en évitant celles à une liaison (1JHX). Afin d’éliminer les constantes 1JHX, un filtre « low-pass » est placé en début de séquence incluant un délai réglé dans les paramètres de la séquence correspondant à :
d = (2 x 1JHX)-1
Ce délai est modifié selon ce que l’on souhaite étudier : structures aliphatiques, aromatiques ou éthyléniques. Il est appliqué lors de l’évolution des systèmes de spins avant la première impulsion à 90° appliquée pour le noyau X. Après impulsion, les systèmes de spins évoluent selon :
d = [2 x (nJHX)]-1 (50 ≤ d ≤ 150 ms)
Ce délai conduit au couplage à longue distance. Une élimination du signal de l’eau (présaturation) est également appliquée en début de séquence. Cette expérience a été réalisée avec comme hétéronoyau le carbone ou l’azote. Les constantes de couplage nJ1H-13C (n = 2 et
MATERIEL ET METHODES
3) sont de l’ordre de la dizaine de Hertz. L’azote 15 est un noyau très peu sensible et ses constantes de couplage à longue distance sont mal connues. Le Tableau 11 indique les paramètres d’acquisition pour les HMBC 1H-13C et 1H-15N :
Tableau 11 : Paramètres d’acquisition des HMBC 1H – 13C, 15N
HMBC 1H – 13C HMBC 1H – 15N Nombre de scans 80 400 Nombre d’expériences 224 200 TD 2 1024 1024 Durée d’acquisition 103 ms 73 ms d6 65 ms 80 ms Fenêtres spectrales F1 = 28928 Hz (230 ppm) F2 = 7003 Hz (14 ppm) F1 = 30000 Hz (600 ppm) F2 = 7003 Hz (14 ppm)
V SYNTHESE DU BENZOISOXAZOLE
OH O O N SO2CH3 1 2 3 4 5 6 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 9'Figure 63 : Structure chimique du benzoisoxazole
Ce dérivé isoxazole, 2-(6’-méthylsulfonylbenzo[c]isoxazol-3’-yl)-3-hydroxycyclohex- 2-èn-6-one (Figure 63), a été synthétisé par réduction de Clemensen selon la méthode décrite par Bellamy et Ou (1984). A une solution de 500 mg de mésotrione (1,5 mmol) dans 20 mL d’éthanol absolu, agitée sous argon est ajouté 1,7 g de SnCl2.2H2Oanhydre (7,5 mmol). Le mélange est chauffé à 70°C pendant une heure. Après refroidissement à température ambiante, le contenu du ballon est versé dans un bain de glace. Le pH du mélange est ajusté à 7 – 8 par addition de soude avant d’être extrait par l’acétate d’éthyle. Un précipité jaune, très important, se forme. Il est filtré sur verre fritté et récupéré. Après séchage dans un dessicateur chauffant, le composé jaune est récupéré avec un rendement de 80 %.
MATERIEL ET METHODES 146 • RMN 1H : (500,13 MHz, H2O :D2O 90 :10, pH = 8) δppm : 2,13 (2H, qt, H5) ; 2,61 (2H, t, H6) ; 3,28 (2H, t, H4) ; 3,39 (3H, s, CH3) ; 8,02 (1H, dd, 1,5Hz, 8,5Hz, H5’) ; 8,56 (1H, d, 8,5Hz, H4’) ; 8,85 (1H, d, 1,5Hz, H7’). • RMN 13C (125,7 MHz, H2O :D2O 90 :10, pH = 8) δppm : 22,8 (C5) ; 28,8 (C4); 41 (C6); 46 (CH3); 115,9 (C2); 120,4 (C7’); 125,2 (C5’); 131 (C4’) ; 133,4 (C9’); 143,8 (C8’) ; 145 (C6’); 161,6 (C3) ; 175,2 (C3’) ; 202,7 (C1).
VI ADSORPTION DE LA MESOTRIONE SUR LES MATRICES
SOLIDES
Le protocole expérimental utilisé est celui décrit précédemment page 129. Les analyses sont réalisées sur une chaîne HPLC Agilent 1100. Les échantillons sont analysés sur une colonne phase inverse Zorbax Eclipse XDB 5µm (C18 150 x 4,6 mm) en mode
isocratique (comme pour le criblage) avec une phase éluante A (H2O + 0,01%
H3PO4)/Acétonitrile = 70/30 (V/V). Le temps de rétention de la mésotrione est alors de 12 min.
MATERIEL ET METHODES
I LES SOUCHES FUSARIUM SOLANI PB1 ET TRAMETES
VERSICOLOR T2
Deux souches de fongiques, Fusarium solani PB1 et Trametes versicolor T2, fournies par le Dr. C. Mougin (INRA Versailles Grignon), sont mises en pré-culture, puis en culture pendant 72 h sur trois milieux différents : Tartrate, Malt et Peptone. Pour 1 L d’eau distillée, la composition est la suivante :
• Milieu Tartrate : Extrait de levure (Difco) 1 g ; tartrate di-Na 2,3 g ; tartrate di-NH4 1,8 g ; glucose 5 g ; Tryptone (Difco) 2 g ; KH2PO4 2 g ; CaCl2. 2H2O 0,14 g ; MgSO4.7H2O 0,7 g ; FeSO4.7H2O 0,07 g ; ZnSO4.7H2O 0,046 g ; MnSO4.H2O 0,035 g et CuSO4.5H2O 0,007 g.
• Milieu Malt : Extrait de Malt (Difco) 20 g ; glucose 20 g et biopolytone (bioMérieux)
2 g.
• Milieu Peptone : Tryptone (Difco) 20 g ; K2HPO4 1 g ; glucose 30 g ; FeSO4.7H2O 0,01 g ; MgSO4 0,5 g ; ZnSO4 0,3 g et KCl 0,5 g.
II INCUBATION DES SOUCHES FUSARIUM SOLANI PB1 ET
TRAMETES VERSICOLOR T2 AVEC LE GLYPHOSATE
Après 72 h de culture, les cellules ont été filtrées sous vide sur verre fritté dans des conditions stériles. Deux lavages successifs avec une solution de NaCl à 8 ‰, préalablement stérilisée, ont été effectués. Pour les cultures sur milieux Malt et Peptone, les cellules sont réparties dans des erlenmeyers de 500 mL stériles, à raison de 5 g de biomasse humide pour 100 mL d’une solution de glyphosate à 0,8 mM. Pour les cultures sur milieu Tartrate, les cellules sont réparties dans des erlenmeyers de 250 mL stériles, à raison de 5 g de biomasse humide pour 30 mL de solution de glyphosate 3 mM préparée préalablement dans une solution de sels et d’oligoéléments (CaCl2.2H2O 0,14 g ; MgSO4.7H2O 0,7 g ; FeSO4.7H2O 0,07 g ; ZnSO4.7H2O 0,046 g ; MnSO4.H2O 0,035 g ; CuSO4.5H2O 0,007 g q.s.p. 1L eau distillée). Les erlenmeyers sont ensuite agités à 200 rpm et à 27°C. Des prélèvements de 2 mL
MATERIEL ET METHODES
148 en conditions stériles sont effectués pendant 15 jours, centrifugés à 12500 rpm pendant 3 min puis congelés à -20 °C jusqu’au moment des analyses RMN et HPLC.
III CONTROLE DES CINETIQUES DE BIODEGRADATION DU
GLYPHOSATE
III.1 Analyses par HPLC
Le glyphosate, comme ses métabolites, ne possèdent aucun groupement chromophore et ne fluorescent pas naturellement. Il est donc nécessaire de réaliser une dérivation avec un dérivé fluorescent pour pouvoir détecter le composé par HPLC. Nous avons choisi d’utiliser le chloroformate de 9-fluorénylméthyle (Fmoc-Cl). La détection par fluorescence est très sensible, la concentration maximale en glyphosate utilisée pour les cinétiques de biodégradation est de 3 mM et l’étalonnage couvre la gamme 0-3 mM. Pour ces concentrations, le récepteur est saturé. Par conséquent, nous avons dilué 200 fois tous les échantillons à analyser avant de les dériver. Le protocole de dérivation utilisé est adapté de celui proposé par Miles et Moye (1988) :
Dans un tube à essai sont mis en contact :
• 0,1 mL d’échantillon
• 0,1 mL d’une solution de FMOC-Cl préparée à 0,01 M dans l’acétonitrile
• 0,9 mL d’acétone grade HPLC
• 0,9 mL d’une solution de tétraborate de sodium à 0,05 M (pH = 9)
Le mélange est agité au Vortex pendant 1 min puis laissé au repos 30 min. Il est ensuite extrait avec 3 fois 1 mL d’acétate d’éthyle. Après agitation entre chaque lavage, la phase organique est éliminée. La phase aqueuse est prélevée après le troisième lavage et transvasée dans un vial pour l’analyse HPLC immédiate.
Les analyses sont effectuées sur une colonne phase inverse Nucleodur 5 µM (C18, 150 x 4,6 mm). Les conditions d’analyse en mode isocratique sont résumées dans le Tableau 12 :
MATERIEL ET METHODES
Tableau 12 : Conditions d’analyse du glyphosate par HPLC
Eluant A/B (V/V) Pour 1 L :
A = 0,05 M KH2PO4 + 4 mL KOH à 2 M (pH = 6,9) B = acétonitrile
A/B = 70/30
Débit 1 mL/min
Température de la colonne 30 °C
Longueur d’onde λexc = 270 nm et λem = 317 nm Temps de rétention Glyphosate : 4 min
AMPA : 25 min Sarcosine : 29 min