Existe-t-il plusieurs E3 ligases pour ERK3 ? 165 

Le chapitre 3 de la thèse décrit un crible fonctionnel RNAi qui nous a mené à identifier l’ubiquitine ligase E6AP comme un régulateur de l’ubiquitination et la dégradation de ERK3. Si nos résultats suggèrent fortement que E6AP est une E3 ligase de ERK3, puisque les deux protéines interagissent et que la modulation de la fonction de E6AP se traduit par une modulation des niveaux d’ubiquitination de ERK3, nous ne pouvons pas exclure que cette régulation soit indirecte. Des études in vitro devront donc être menées pour déterminer si ERK3 est un substrat direct de E6AP.

De la même façon que pour les DUB, certaines de nos données suggèrent qu’il n’existe pas une ubiquitine ligase unique de ERK3, mais un réseau d’enzymes aux fonctions redondantes qui coopèrent pour déstabiliser la protéine. Plusieurs de nos observations soutiennent l’hypothèse de ces régulateurs multiples. Premièrement, l’inhibition de l’activité d’une seule ligase (expression de E6AP DN) ou d’une sous-famille de ligases (inhibition chimique des complexes CRL) induit une accumulation de ERK3 relativement faible comparativement à ce qui est observé pour l’inhibition du protéasome. Deuxièmement, l’inhibition de l’expression des E2 conjugases identifiées dans nos cribles de régulateurs induit une accumulation de ERK3 plus élevée, comparativement à ce qui est observé pour les E3 ligases. Étant donné que plusieurs enzymes E3 peuvent collaborer avec une seule enzyme E2, ce résultat suggère encore une fois une redondance entre des E3 ligases pour la déstabilisation de ERK3.

Il doit donc exister d’autres régulateurs qui collaborent avec E6AP pour réguler ERK3. Parmi ces candidats se trouvent certains des complexes de type CRL, puisque nous rapportons que leur inhibition induit une augmentation de l’expression de ERK3. Cette observation a aussi été rapportée dans la littérature pour les complexes CRL4, pour lesquelles l’expression d’un DN induit une accumulation de ERK3 (281). De plus des expériences d’identification des interacteurs de ERK3 à grande échelle par purification par affinité couplée à de la spectrométrie de masse, menées dans le laboratoire, ont permis d’identifier DDB1, une sous- unité des complexes CRL4, comme une protéine liant ERK3. Nous avons confirmé cette interaction par des expériences de co-immunoprécipitation (figure 2). Les expériences

d’interactomique ont aussi permis d’identifier trois protéines de type DCAF (DDB1 and CUL4-associated factors), GRWD1, RBBP4 et RBBP7, qui sont des sous-unités des complexes CRL4 qui servent de récepteurs aux substrats (545).

Figure 1. Erk3 interagit avec DDB1.

Des cellules 293T ont été transfectées avec les constructions indiquées. 36h après transfections, les complexes protéiques ont été immunoprécipités avec des anticorps dirigés contre le marqueur Flag. L’interaction entre ERK3 et DDB1 a été évaluée par immunobuvardage.

Notre crible fonctionnel ciblant les E3 ligases a aussi mené à l’identification des sous- unités des complexes CRL3 et CRL7. En revanche, cette expérience n’a pas permis d’identifier les cullines ou la protéine RBX1, qui est présente dans tous les complexes CRL, comme régulateurs potentiels de ERK3. Néanmoins, une inspection détaillée des résultats, notamment des données de normalisation par la viabilité cellulaire, nous indique que l’inhibition de l’expression de ces protéines semble être inhibiteur de la prolifération et/ou inducteur de la mortalité cellulaire. Il existe donc plusieurs données qui pointent vers un rôle des complexes CRL dans le contrôle de la stabilité de ERK3. Cette régulation, particulièrement celle des complexes CRL4, pourrait donc faire l’objet d’une étude plus détaillée.

Notre crible nous a permis de découvrir d’autres régulateurs potentiels de ERK3. Ainsi, parmi les E2 conjugases, le candidat qui induit le plus d’accumulation de ERK3 est UBE2I, mieux connu sous le nom de Ubc9, qui est la seule SUMO conjugase encodée par le génome humain (546). Il existe des phénomènes de couplage bien connus entre les processus de SUMOylation et d’ubiquitination pour gouverner la dégradation des protéines. Le plus connu d’entre eux est l’existence d’ubiquitines ligases dépendantes de SUMO (voir revue (547)). Il s’agit d’enzymes qui reconnaissent des substrats protéiques ayant été préalablement SUMOylés. L’ubiquitine ligase dépendante de SUMO la mieux caractérisée est sans doute RNF4 (548). De manière intéressante il s’agit aussi d’un des candidats régulateurs de ERK3 identifié dans notre crible. De plus, l’analyse des interactions E3/E2 nous indique que nous avons potentiellement identifié plusieurs complexes RNF4-E2 conjugases régulateurs de ERK3 (Chapitre 3 et (408)). Néanmoins, il n’existe pas de motif consensus Ψ-K-x-D/E de SUMOylation dans la séquence de ERK3. En revanche, il a déjà été montré que certaines protéines peuvent être SUMOylées sur des sites « non-consensus » (549). L’utilisation du logiciel de prédiction en ligne SUMOplot indique plusieurs sites de SUMOylation potentiels pour ERK3, dont la lysine 168 où la probabilité de SUMOylation est définie comme haute par le programme (figure 3).

Figure 2. Prédiction des sites de SUMOylation sur la protéine ERK3.

Copie d’écran réalisée avec le programme en ligne SUMOplot.

Il serait donc intéressant de déterminer si ERK3 est SUMOylée et si cette modification altère son ubiquitination et sa dégradation, notamment via l’activité de la ligase RNF4. La

caractérisation de substrats de la SUMOylation peut s’avérer difficile, spécifiquement dans le cas d’une protéine ubiquitinée comme ERK3, à cause de l’existence de chaînes mixtes ubiquitine/SUMO. Il existe néanmoins des techniques, basées sur l’utilisation de la spectrométrie de masse et de tests de lien entre protéines (proximity ligation assay), qui permettent de détecter la SUMOylation d’une protéine in vitro et in vivo (550-552). Cette étape permettrait ensuite de déterminer si la ligase RNF4 régule une forme SUMOylée de ERK3.