Examen microbiologique :

Des protocoles conçus conjointement par les cliniciens et les microbiologistes sont indispensables pour obtenir un résultat cliniquement utile. Ces protocoles doivent définir les objectifs de l’analyse, la manière de prélever selon les différentes présentations cliniques, le matériel à utiliser, les conditions de transport, les techniques analytiques et l’interprétation des résultats (souvent très variés) de la culture. Le but est d’obtenir l’isolement et l’identification du ou des micro-organisme(s) responsable(s) de l’infection à partir d’un prélèvement, en évitant sa contamination par la flore commensale qui colonise la peau. Il n’existe pas de

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consensus quant à la meilleure technique à appliquer [71], les études étant trop rares et les preuves trop faibles pour en tirer des recommandations valables [72].

Avant tout prélèvement, la plaie doit être préparée [24] :

 Débridement mécanique au moyen d'une curette ou d'un scalpel stériles (pas de débridement si ulcère ischémique : se limiter a un simple drainage).

 Privilégier le nettoyage avec une gaze imbibée de sérum physiologique stérile. L'utilisation d'antiseptiques est possible, mais ceux-ci doivent être éliminés par du sérum physiologique stérile avant de réaliser le prélèvement.

 Pas d’écouvillonnage superficiel de la plaie.

 Les prélèvements doivent être transmis le plus rapidement possible (< 2 h) au laboratoire de microbiologie (risque important de dessiccation et de lyse bactérienne) et conserves à température ambiante jusqu'a l'ensemencement.  L'ensemencement des prélèvements dans des flacons d'hémocultures n'est pas

recommandé (risque de multiplication de la flore commensale non pathogène au détriment des bactéries réellement infectantes).

 Prélèvements à répéter en cas d'évolution défavorable ou si l'état septique du patient est inquiétant.

 L'interprétation des résultats doit tenir compte des conditions de recueil, de transport et du type de bactéries isolées.

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Tableau IX : Situations devant faire évoquer le diagnostic

d’ostéite du pied diabétique [81].

Plaie de grande taille (surface > 2 cm2, profondeur > 3 mm). - Durée d’évolution supérieure à deux semaines. - Plaie en regard d’une structure ostéo-articulaire.

- Toute plaie qui ne cicatrise pas, malgré un traitement bien conduit pendant plus de 6 semaines.

- Os exposé ou issu de fragment osseux au travers d’une plaie. - Contact osseux rugueux lors de l’exploration de la plaie.

- Pied inflammatoire chez un patient aux antécédents de plaie du pied. - Aspect d’orteil en « saucisse ».

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Figure 26 : Schématisation des prélèvements à pratiquer en fonction du type de plaies identifiées chez

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3.1 Méthodes d’isolement microbiologique :

3.1.1 Biopsie osseuse :

La biopsie Osseuse est le prélèvement de fragments de tissu osseux sur un être vivant afin de le soumettre à une étude microscopique, bactériologique, biochimique, histologique dans un but diagnostique et/ou thérapeutique. Elle est la méthode de référence pour le diagnostic bactériologique d’ostéite mais elle est rarement réalisée en dehors des centres spécialisés. Elle est encore plus justifiée en cas d’échec d’une première antibiothérapie et doit être réalisée après une fenêtre thérapeutique de 15 jours [26].

Le fragment osseux peut être prélevé par chirurgie à ciel ouvert ou par ponction percutanée.

3.1.2 Ecouvillonnage superficiel de la plaie :

C’est la méthode la plus utilisée car la plus facile, mais elle demeure peu adaptée à la mise en évidence optimale des bactéries réellement responsables de l’infection [62, 73], bien que certains auteurs obtiennent une bonne corrélation entre les résultats de cette technique et ceux obtenus par prélèvements profonds. Aucune méthodologie n’a été validée, mais la technique consiste le plus souvent à passer un écouvillon de coton sur une surface de 1 cm² de la plaie, dans un mouvement en zigzag combiné à une rotation [74, 75]. L’inconvénient de cette méthode est qu’elle recueille la totalité de la flore aérobie colonisante si la préparation n’est pas optimale et qu’elle ignore souvent les bactéries anaérobies strictes [76]. Ces dernières ne sont généralement pas recherchées bien que ce soit techniquement possible. Cette méthode de prélèvement a un intérêt limité et devrait être réservée au cas où les autres techniques décrites ci-dessous ne peuvent être appliquées [68].

3.1.3 Curetage–écouvillonnage profond de l’ulcère :

Ce prélèvement nécessite de racler ou de cureter le tissu à la base et sur les bords de l’ulcère avant de nettoyer la plaie puis de passer un écouvillon. Cette méthode est indiquée pour les prélèvements superficiels et les plaies anfractueuses profondes. Elle fournit des résultats plus spécifiques (identification plus rare de bactéries colonisantes) que l’écouvillonnage simple [82, 60]. Une recherche de bactéries anaérobies strictes est possible

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mais elle nécessite des conditions de prélèvement particulières : écouvillon avec de l’alginate, maintien de la chaine d’anaérobiose jusqu’a l’ensemencement au laboratoire. L’interprétation des résultats obtenus par cette méthode est plus simple pour le clinicien car ce prélèvement permet un isolement optimal des bactéries infectantes.

3.1.4 Biopsie tissulaire :

Même si elle est encore peu utilisée, c’est la méthode à privilégier [62]. La sévérité de la neuropathie autorise souvent une biopsie au lit du patient sans préparation particulière. Deux à trois fragments de tissu sont obtenus à partir de plusieurs zones ; immédiatement déposés dans un tube stérile additionné de quelques gouttes de sérum physiologique pour éviter la dessiccation. La signification clinique d’une analyse quantitative des tissus n’a pas été clairement démontrée [83].

3.1.5 Aspiration à l’aiguille fine :

Tout liquide purulent, collecté dans un abcès profond, doit être aspiré à l’aide d’une aiguille fine. La ponction doit être effectuée en passant par une zone cutanée saine bien désinfectée (détersion suivie d’un antiseptique). Cependant certains auteurs proposent quand même de passer au travers de la plaie superficielle (si elle existe), aprés nettoyage de celle-ci [82, 60]. En cas d’infection osseuse suspectée à l’imagerie, un prélèvement à l’aiguille fine au contact de l’os infecté est proposé lorsque la biopsie osseuse n’est pas réalisable (prélèvements itératifs ou infection peu étendue). En cas de plaie sèche, 1 à 2 ml de sérum physiologique peuvent être injectés dans la profondeur de la plaie puis réaspirés pour être analysés. Cette méthode permet de rechercher des bactéries anaérobies, à condition que la chaine d’anaérobiose soit maintenue depuis le prélèvement jusqu'à l’ensemencement au laboratoire. La seringue ayant servi au prélèvement sera envoyée au laboratoire sans aiguille, purgée d’air et bouchée hermétiquement et stérilement. Cette technique doit être pratiquée devant toutes les plaies profondes collectées ou anfractueuses notamment lorsque les prélèvements par écouvillonnage sont proscrits.

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3.1.6 Hémocultures aérobies et anaérobies

Les hémocultures sont particulièrement utiles dans le cadre de sepsis [84,85].

3.2 Préparations des prélèvements :

Des prélèvements répétés sont conseillés en cas d’évolution défavorable ou si l’état septique du patient est inquiétant. Les prélèvements doivent être transportés dans des conditions optimales. Ils doivent être transmis le plus rapidement possible au laboratoire de microbiologie, ce qui nécessite une collaboration étroite entre cliniciens, infirmiers et coursiers, en raison du risque important de dessiccation et de lyse bactérienne. Ces échantillons devraient bénéficier de milieux de transport [86,87] pour augmenter la durée de survie des germes [88]. Ils doivent être conservés à température ambiante jusqu’à l’ensemencement. L’ensemencement direct de flacons d’hémoculture n’est pas recommandé en raison du risque de multiplication de la flore commensale non pathogène au détriment des bactéries réellement infectantes.

Au laboratoire, les écouvillons doivent être déchargés dans un bouillon. Les tissus doivent être découpés et broyés avant ensemencement. Tous ces échantillons ainsi que pus et aspirations doivent être ensemencés sur des milieux traditionnels et incubés à 37 °C. Les échantillons provenant de tissus profonds et d’aspirations seront aussi cultivés en anaérobiose, à condition que la chaîne d’anaérobiose ait été maintenue depuis le prélèvement jusqu’à l’ensemencement. Il existe une faible corrélation entre le résultat de la coloration de Gram et celui de la culture de biopsies tissulaires [44].

3.3 Coloration de Gram :

Technique de coloration qui est la plus utilisée dans l'étude et la classification des bactéries en deux grands groupes : les bactéries à Gram positif et à Gram négatif.

Le principe de cette méthode, mise au point de façon empirique par le médecin danois Gram en 1884, est le suivant : on étale les bactéries sur une lame de verre, on les fixe par la chaleur ou l'alcool, puis on les colore successivement avec une solution de violet de gentiane et un mordant, la liqueur de Gram, ou solution de Lugol (mélange d'iode et d'iodure de

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potassium) ; la préparation est ensuite traitée avec un solvant organique, tel que l'alcool. Certaines bactéries, dites à Gram positif, résistent à la décoloration par l'alcool. Les autres, appelées bactéries à Gram négatif, sont rapidement décolorées. Après le solvant, on procède à une contre-coloration avec un colorant rouge, comme la fuchsine de Ziehl diluée. Les bactéries à Gram positif apparaissent alors en violet, tandis que les bactéries à Gram négatif, qui acceptent le contre-colorant, sont rouge clair.

Cette méthode de coloration repose sur une différence fondamentale entre la composition chimique des parois des bactéries à Gram positif et à Gram négatif. En effet, la paroi s'interpose comme une barrière pour empêcher l'accès du cytoplasme (sur lequel se fixerait le colorant) aux agents décolorants et à l'élution du complexe coloré. L'incapacité des cellules à Gram négatif à interdire cet accès résulte de la teneur élevée de leurs parois en lipides qui sont facilement dissous dans l'alcool ; celui-ci passe alors facilement à travers la membrane cellulaire, dissout le complexe coloré, l'élimine et laisse la cellule incolore [8].

3.4 Nature des milieux de cultures :

La plupart des bactéries peuvent être cultivées sur des milieux de culture artificiels fournissant les nutriments nécessaires à la croissance. Certaines bactéries sont des parasites intracellulaires obligatoires, et sont cultivables seulement in vivo ou sur des cultures cellulaires.

Les bactéries cultivables peuvent pousser sur des milieux nutritifs non sélectifs comme la gélose au sang, ou sur des milieux sélectifs, dans lesquels la présence d'adjuvant (ex la bile dans le milieu de MacConkey) ou d'antibiotique (ex. vancomycine ou colistine) permet de limiter la pousse à certaines espèces seulement. II existe des bactéries strictement anaérobies qui ne se développent qu'en atmosphère dépourvue d'oxygène Dans un laboratoire de diagnostic, on utilise des milieux et des conditions de cultures différentes pour isoler telle ou telle bactérie à partir d'échantillons cliniques [78].

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Tableau X : Milieux de cultures bactériennes [78]. Milieux de cultures bactériennes

Milieux Principaux ingrédients Utilisations

Gélose au sang frais Gélose nutritive+5% de sang de cheval ou mouton

Milieu non sélectif pour grande variété de bactéries à Gram positif et négatif peu exigeantes.

Gélose au chocolat Gélose au sang chauffé. Les hématies sont lysées et libérent des facteurs de croissances (X et V).

Culture des Haemophilus et des

Neisseria.

Milieu de chapman Base peptonée contenant du mannitol, du chlorure de sodium et du rouge de phénol.

Milieu sélectif et différentiel pour l’isolement de Staphylococcus aureus.

Milieu de BCP (Bromocrésol-pourpre)

Extrait de viande de bœuf + Peptones + Lactose + Bromocrésol pourpre + Agar.

Milieu d’isolement des bactéries peu exigeantes (absence d’agent sélectif) et d’étude de la dégradation du lactose par les bactéries.

Milieu de BEA (Bile Esculine Agar)

Extrait de viande + Peptones + Citrate de fer + Esculine+ Bile de bœuf + Agar.

Milieu d’isolement sélectif des bactéries du genre Streptococcus appartenant au groupe D et les bactéries du genre Enterococcus.

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3.5 Identification biochimique :

L’identification des micro-organismes isolés se fait par différentes tests biochimiques. Tableau XI : Exemples de réactions biochimiques d’identification des bactéries [78]. Réaction Principe de la réaction Exemples d’application

Catalase L’enzyme dissocie H2O2 en formant des bulles d’oxygène

Différenciation des streptocoques (-) des staphylocoques (+).

Coagulase L’enzyme coagule le plasma Différenciation des staphylocoques à coagulase + (S.aureus)

des staphylocoques à coagulase -

Oxydation-fermentation

Incubation des germes en milieu glucosé en aérobiose (oxydation) et en anaérobiose (fermentation).

Distinction entre les germes à métabolisme strictement oxydatif (ex :

Pseudomonas) et les fermentants (ex :

entérobactéries).

Production d’indole Le tryptophane est métabolisé en indole que colore en rouge le réactif de Kovacs

Distinction en E.coli et d’autres entérobactéries (E.coli est indole +)

ADNase

Une désoxyribonucléase hydrolyse l’ADN. L’ADN non hydrolysé précipite en présence d’acide chlorhydrique.

Distinction entre S.aureus ADNase+ et les autres staphylocoques (ADNase -).

Rouge de méthyle Production d’acide en quantité suffisante pour faire virer l’indicateur au rouge.

Distinction entre E.coli et les

Enterobacter.

Réduction de nitrate Détection d’une nitrate réductase par formation de nitrites.

Différenciation des entérobactéries (réaction +) d’autres bacilles à Gram négatif.

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3.5 Antibiogramme :

L’antibiogramme est réalisé par la technique de diffusion en milieu gélosé selon les recommandations du comité de l’antibiogramme de la société française de microbiologie.

Pour chaque bactérie identifiée, on utilise soit deux boîtes rondes de 90mm de diamètre soit une boîte carrée de 180 mm contenant de la gélose MUELLER HINTON ; les disques des antibiotiques utilisés sont choisis en fonction de la bactérie étudiée (staphylocoque, entérobactéries, streptocoques, bacilles à Gram négatif).

L’inoculum préparé à partir de la suspension bactérienne qui a servi pour l’ensemencement (réalisé par inondation) de la galerie d’identification est ajusté en fonction du type de la bactérie. L’excès d’inoculum est aspiré par la pipette «pasteur» et la boîte séchée pendant un quart d’heure à l’étuve après que les disques d’antibiotiques aient été déposés sur la gélose en respectant un emplacement permettant de déterminer les différents phénotypes.

La lecture de l’antibiogramme est faite manuelle ou semi automatique [26].

Figure 27 : Antibiogramme de Streptococcus agalactiae (sur milieu de Mueller Hinton au sang frais) [26].

E : érythromycine ; VA : vancomycine ; CF : céfalotine ; AM : ampicilline ;

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 L’écologie des bactéries multirésistantes est à prendre en compte et leur isolement nécessite des mesures d’hygiène adaptées. Les souches de Staphylococcus aureus isolées des plaies et résistantes à la méticilline (SARM) constituent actuellement un problème de première importance. Parmi les cocci à Gram positif, deux autres bactéries multirésistantes sont à surveiller : les entérocoques résistants à la vancomycine (VRE) et Staphylococcus aureus de sensibilité diminuée aux glycopeptides (GISA). Par ailleurs, sont également isolées des entérobactéries résistantes aux céphalosporines de 3ème génération (β-lactamase à spectre étendu ou céphalosporinase déréprimée), Pseudomonas aeruginosa et des bactéries de l’environnement multirésistantes (Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumanii) [26].

4. Examens d’imagerie :