Manifestations cliniques :
2- Examen direct :
L’examen direct du prélèvement permet une orientation rapide du diagnostic, et permet la mise en évidence dans 70 % des cas d'éléments bourgeonnants et de pseudo-filaments évocateurs.
Sa qualité dépend de celle du prélèvement qui doit être pratiqué par des personnes compétentes pour chaque type de prélèvement (prélèvements d’ongles, biopsies cutanées, fibroscopie...).
L’examen direct se fait au microscope, à l’état frais entre lame et lamelle. Il est facilité par l’emploi de colorants pour accentuer les contrastes. En particulier, l’emploi d’agents clarifiants (Calcofluor®, Blankophor®, Uvitex®) permet de mieux identifier les éléments fongiques sous réserve d’employer un microscope à fluorescence avec des jeux de filtres adéquats (Figure. 19). [44]
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Les levures apparaissent sous forme arrondie ou ovalaire, de 6 à 8 µm dans longueur.
La présence de filaments oriente vers les espèces capables d’en produire et
C. glabrata, incapable de filamenter.
Les levures sont également visibles sur des frottis colorés au Gram (les levures sont à Gram positif), mais la lecture à un fort grossissement pour observer les bactéries diminue la sensibilité de cet examen.
L’examinateur peut également donner une évaluation semi
quantitative dans certains types de prélèvements comme les urines ou le bronchoalvéolaire. [44]
Figure 19 : Examen direct d’une hémoculture positive à l’aide d’un agent clarifiant (Blankophor®) et d’un microscope à fluorescence. Examen à faible grossissement (× 200) montrant des levures bourgeonnantes san
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sous forme arrondie ou ovalaire, de 6 à 8 µm dans
oriente vers les espèces capables d’en produire et , incapable de filamenter.
Les levures sont également visibles sur des frottis colorés au Gram (les levures sont à Gram cture à un fort grossissement pour observer les bactéries diminue la
L’examinateur peut également donner une évaluation semi-quantitative des éléments, voire quantitative dans certains types de prélèvements comme les urines ou le
: Examen direct d’une hémoculture positive à l’aide d’un agent clarifiant (Blankophor®) et d’un microscope à fluorescence. Examen à faible grossissement (× 200) montrant des levures bourgeonnantes sans filament identifiées après culture comme
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sous forme arrondie ou ovalaire, de 6 à 8 µm dans leur plus grande
oriente vers les espèces capables d’en produire et élimine ainsi
Les levures sont également visibles sur des frottis colorés au Gram (les levures sont à Gram cture à un fort grossissement pour observer les bactéries diminue la
quantitative des éléments, voire quantitative dans certains types de prélèvements comme les urines ou le liquide de lavage
: Examen direct d’une hémoculture positive à l’aide d’un agent clarifiant (Blankophor®) et d’un microscope à fluorescence. s filament identifiées après culture comme Candida kefyr
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3- La culture :
Les levures du genre Candida croissent sans trop de difficultés sur de nombreux milieux bactériologiques.
Quand les prélèvements sont polymicrobiens, l’inhibition de la pousse des bactéries est nécessaire pour individualiser les levures.
Une recherche fongique spécifique inclut donc l’ensemencement sur milieux contenant des antibiotiques, classiquement le milieu de Sabouraud additionné de chloramphénicol et de gentamicine.
Le milieu à l'actidione inhibe par ailleurs la culture de certaines espèces de Candida (krusei,
tropicalis, parapsilosis) et concourt ainsi à leur identification.
Le diagnostic de candidoses systémiques repose sur les hémocultures. La méthode de lyse-centrifugation est de réalisation délicate, ne peut être faite en dehors des heures d’ouverture du laboratoire et expose au risque de manipulations de produits sanguins.
Son principe repose sur une lyse des globules blancs, une centrifugation pour se débarrasser du surnageant, contenant possiblement les inhibiteurs, et concentrer les éléments infectieux, et un ensemencement du culot sur boîte de Pétri ou sur tubes.
Elle garde une indication particulière quand les prélèvements sont effectués sous antifongiques, si une quantification de l’inoculum est souhaitable, ou si une infection mixte, levures et bactéries est suspectée.
La séparation des colonies bactériennes des colonies fongiques permet leur identification réciproque.
Parmi les automates d’hémocultures, seuls persistent les automates à mesure continue. De récentes publications rapportent les évaluations de différents couples automate-milieux dont la sensibilité est voisine.
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Pour l’isolement des levures, les résultats montrent une légère supériorité des milieux BacT/Alert sur les milieux Bactec Standard.48. [44]
4- Examen anatomopathologique :
Celui-ci doit être demandé le plus souvent possible, en particulier lors de suspicion de candidose systémique.
Les structures fongiques sont mieux vues à l’acide périodique de Schiff et aux colorations spécifiques à l’argent. Sur une biopsie cutanée, seul l’examen anatomopathologique permet de confirmer que la levure est bien intradermique et issue d’une dissémination vasculaire, et non pas superficielle, résultat d’une contamination cutanée. La présence de filament permet aussi d’éliminer certaines levures qui ne filamentent pas (C. glabrata).
En revanche, seule la culture permet de facilement identifier l’espèce responsable.
5- Identification :
L’identification des Candida s’effectue à l’aide de critères phénotypiques tels que la production de filaments, de chlamydospores, et l’assimilation ou la fermentation de certains sucres à l’aide de galeries (API AUX 20C ou 32C, BioMérieux).
Ces techniques obligent à travailler sur colonies isolées et nécessitent généralement 24 heures au minimum après l’isolement pour une identification de l’espèce.
Historiquement, le diagnostic d’espèce de C. albicans reposait sur le test de filamentation rapide en sérum à 37 °C et la formation de chlamydospores sur milieu pauvre. Pour les autres espèces, le diagnostic reposait, et repose encore en grande partie, sur les caractères phénotypiques tels que la croissance et la fermentation de certains sucres étudiés à l’aide de galeries (Api Candida, Api 20C AUX ou ID 32C, BioMérieux ; Auxacolor® 2, Bio-Rad). Des progrès importants ont été réalisés par la mise à disposition de milieux comportant des chromogènes.
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Les colonies de levures, normalement blanc crème, sont colorées suivant l’espèce
(Figure. 20).
L’identification des levures, en particulier Candida albicans, est alors possible dès la visualisation de la colonie sans nécessiter de repiquage (CHROMagar®, Becton Dickinson ; Candida ID®, BioMérieux). [45-46]
Ainsi l’identification est-elle rendue avec un gain de 24 voire 48 heures. Ces milieux peuvent aussi identifier et quantifier les mélanges de levures, particulièrement utiles pour suivre les colonisations des patients à risque.
Figure 20: Aspect des colonies de différentes espèces de Candida (C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei) sur
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Il existe également des tests d’identification simples et rapides, soit basés sur l’agglutination de particules de latex pour C. albicans, C. krusei et C. dubliniensis (Bichro-Latex® Albicans Fumouze, Krusei-Color Fumouze®, Bichro-Dubli Fumouze®, Fumouze), soit sur des activités enzymatiques particulières pour C. glabrata (Glabrata RTT Fumouze®, Fumouze). Des méthodes moléculaires d’identification, principalement le séquençage de régions d’acide désoxyribonucléique (ADN) polymorphe, sont décrites pour les Candida non caractérisés par les méthodes phénotypiques habituelles. Ces méthodes doivent gagner en simplicité et en coût pour pouvoir concurrencer les méthodes phénotypiques actuelles.
Le développement de puces d’ADN pour identification va dans ce sens, mais n’est pour l’instant pas d’actualité pour les laboratoires d’analyses, en particulier parce qu’elles nécessitent de travailler soit sur des colonies déjà isolées, ce qui diminue leur intérêt pour la rapidité du diagnostic, soit après une étape d’amplification par PCR.
Les méthodes moléculaires peuvent également être utilisées pour le typage des isolats, à l’intérieur d’une espèce donnée. Leur application essentielle en clinique est l’étude du caractère nosocomial ou non. Plusieurs méthodes ont été publiées.
Celles basées sur le polymorphisme de microsatellites devraient se développer [47], ainsi que celles basées sur le séquençage de gènes de ménage [48], alors que celles faisant appel au
randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) sont de moins en moins utilisées en raison de
leur non-reproductibilité
Les principaux résultats des typages moléculaires ont été de démontrer que la souche colonisante est la souche infectante dans l’immense majorité des cas [49], avec comme conséquence la possibilité de cibler la souche infectante dans le traitement initial d’une hémoculture positive à Candida.
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