Evaluation in vitro de l’effet du gadodiamide sur les spectres 1 H

Les effets des agents de contraste à base de gadolinium (GBCA) sur les pics en 1H SRM étant peu connus, une évaluation in vitro a précédé l’étude in vivo. En effet, le gadodiamide accumulé dans le cervelet pourrait influencer le signal des métabolites et induire une erreur dans la quantification des spectres 1H in vivo. Il a été vérifié in vitro que les pics n’étaient pas altérés qualitativement (largeur des pics) et quantitativement (aire sous les pics) en présence de gadodiamide.

4.1.1.1. Préparation des fantômes

Des tubes fantômes contenant NAA, créatine et choline à une concentration de 10 mM représentatives du cerveau ont été préparés avec ou sans gadodiamide (Omniscan®, GE Healthcare). Le choix des concentrations de gadodiamide testées s’est appuyé sur les concentrations mesurées par ICP-MS au niveau des noyaux cérébelleux profonds chez le rat (Robert et al. 2016).

Trois lots de tubes ont été préparés selon les conditions suivantes (n=3/groupe) : (i) Contrôle (mélange des métabolites dans NaCl 0,9% et dans un gel d’agarose 1%, sans gadodiamide) ; (ii) Gadodiamide 12,5 µM (mélange des métabolites avec 12,5 µM de gadodiamide dans un gel d’agarose 1%) et (iii) Gadodiamide 50 µM (mélange des métabolites avec 50 µM de gadodiamide dans un gel d’agarose 1%).

4.1.1.2. Acquisition 1_{H SRM et analyse des spectres}

Les acquisitions de résonance magnétique ont été réalisées avec un aimant supraconducteur 7 Tesla Pharmascan 70/16 (Bruker, Wissembourg, France) avec des gradients blindés présentant une amplitude de gradient maximum de 230 mT.m-1 et un diamètre intérieur de 90 mm. Une bobine de transmission et réception de type quadrature avec un diamètre interne de 38 mm a été utilisée.

La séquence Ig-FLASH (Intra-gate Fast Low Angle Shot) a été utilisée pour le placement du voxel en 1_{H SRM. La séquence Ig-FLASH pondérée en T1 a été paramétrée avec : TE/TR,}

2,3 ms/129 ms ; angle de bascule, 60°; 2 accumulations ; résolution dans le plan, 59x59 μm2_{/pixel ; épaisseur de la coupe, 570 µm ; 5 coupes ; temps d’acquisition, 2 min 15}

80 Les paramètres de la séquence PRESS sont identiques aux expériences in vivo : taille voxel, 3 x 2 x 1,5 mm3 ; TE/TR, 16 ms/2775 ms ; 970 accumulations ; bande spectrale, 4006,41 Hz (13,34 ppm) ; 2048 points ; temps d’acquisition, 44 min 52 secondes. Le module de suppression d’eau VAPOR a été utilisé afin de pouvoir observer les métabolites. Le module OVS est activé pour supprimer le signal en dehors du voxel. Une homogénéisation du champ magnétique B0 de premier et second ordre a été effectuée au sein du voxel.

Les spectres ont été analysés sur TopSpin 3.2 (Bruker, Ettlingen, Germany). Après une transformée de Fourier, une apodisation de 3 Hz a été appliquée. Le résidu de l’eau à 0 ppm a été calibré à δ=4.8 ppm. Une correction manuelle de la phase de zéro et de premier ordre ainsi qu’une correction de la ligne de base de type spline cubique ont été effectuées. Les aires sous les pics (Cr, NAA, Cho) ont été mesurées en utilisant le pic ERETIC digital (Electronic Reference To access In vivo Concentrations ; TopSpin 3.2, Bruker) calibré à 1. Les aires sous les pics sont exprimées en unité arbitraire (U.A.).

4.1.2. Modèle animal des injections répétées

Les traitements ont été réalisés par Véronique Vives et Philipe Robert du département Recherche et Innovation de Guerbet (Aulnay-sous-Bois, France).

Les procédures d’expérimentation animale ont été réalisées en accord avec les recommandations de l’Union Européenne (2010/63/EU) pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et conformément aux règles d’éthique du ministère français de l’agriculture et de la forêt (service de santé animale et service de protection vétérinaire). Le modèle des injections cumulatives d’agent de contraste à base de gadolinium a été précédemment décrit (Robert et al. 2015, 2016). Vingt rates Sprague-Dawley (Charles River, L’Arbresle, France) ont été divisées en deux groupes expérimentaux. Les rates du groupe gadodiamide (Omniscan®, GE Healthcare) (n=10) ont reçu 4 injections/semaine de gadodiamide à 0,6 mmol Gd/kg par voie intraveineuse pendant 5 semaines. La dose cumulée pour les 20 injections est de de 1,2 mL/kg de gadodiamide. Les rates du groupe contrôle (n=10) ont reçu 20 injections intraveineuses de solution saline (300 mOsm/kg H2O Gd/kg)

avec le même protocole d’injection.

Toutes les injections ont été effectuées sous anesthésie générale (3-3,5% isoflurane). La dose journalière de 0,6 mmol Gd/kg est équivalente à la dose classiquement utilisée chez l’Homme

81 (0,1 mmol Gd/kg) après ajustement au poids corporel comme il a été recommandé par l’agence américaine FDA.

Un suivi longitudinal des rates a été réalisé en IRM et 1H SRM au mois 0 (M0 ; une semaine après la dernière injection), à M1 (6 semaines post-injections) et M13 (54-55 semaines post- injections). Aux semaines 61-62 post-injections, les animaux ont été sacrifiés et les cerveaux ont été prélevés pour réaliser une analyse histologique (Fig. 4.1).

Figure 4.1 : Protocole expérimental des injections répétées de gadodiamide et suivi longitudinal en IRM et 1H SRM

En parallèle, le suivi des poids des rates a été effectué 4 fois pendant les 5 semaines d’injections puis à M0 (1 semaine post-injections), M1 (6 semaines post-injections), S22 (17 semaines post-injections), S30 (25 semaines post-injections), S38 (33 semaines post- injections) et M13 (54-55 semaines post-injections).

4.1.3. Les expériences IRM et 1_{H SRM in vivo}

Les expériences IRM et 1H SRM ont été effectuées à M0 (une semaine post-injections), à M1 (6 semaines post-injections) et M13 (54-55 semaines post-injections) avec un aimant supraconducteur 7 Tesla Pharmascan 70/16 (Bruker, Wissembourg, France). Une bobine de transmission et réception de type quadrature avec un diamètre interne de 38 mm a été utilisée. L’anesthésie des animaux a été induite par inhalation de 2% isoflurane mélangée dans l’air et l’oxygène (ratio 1 :1) et un débit de 0,5 L.min-1_{. L’anesthésie est stabilisée à 1,5% durant les}

acquisitions. La température corporelle physiologique des animaux est maintenue à l’intérieur de l’aimant par un système de circulation d’eau chaude. Un capteur de pression est placé au niveau de l’abdomen des animaux afin de surveiller la fréquence respiratoire et de s’assurer de l’efficacité de l’anesthésie.

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 IRM

La séquence Ig-FLASH (Intra-gate Fast Low Angle Shot) pondérée en T1 a été utilisée pour les mesures d’intensité du signal dans les noyaux cérébelleux profonds (NCP), le cortex cérébelleux et le tronc cérébral. A l’aide de ces mesures d’intensité, des ratios (Cf. 4.1.4.1.) ont été calculés pour quantifier l’hypersignal induit par les injections répétées de gadodiamide dans les NCP. La séquence Ig-FLASH a également été utilisée pour le placement du voxel au sein des NCP en 1H SRM. La séquence Ig-FLASH a été paramétrée avec : TE/TR, 2,3 ms/129 ms ; angle de bascule, 60°; 6 accumulations ; résolution dans le plan, 78x78 μm2_{/pixel ; épaisseur de la coupe, 570 µm ; 15 coupes ; fréquence respiratoire}

pour la reconstruction, ~40 cycles/min ; temps d’acquisition, 6 min 38 s.

 1_{H SRM}

Le profil métabolique des NCP a été quantifié par 1H SRM à l’aide d’une séquence PRESS (Point Resolved Spectroscopy) afin de déterminer l’influence des injections cumulatives de gadodiamide. Les paramètres de la séquence PRESS ont été les suivants : taille voxel, 3 x 2 x 1,5 mm3 ; TE/TR, 16 ms/2775 ms ; 970 accumulations ; bande spectrale, 4006,41 Hz (13,34 ppm) ; 2048 points ; temps d’acquisition, 44 min 52 secondes. Le module de suppression d’eau VAPOR a été utilisé afin de pouvoir observer les métabolites cérébraux. Le module de localisation OVS est activé pour supprimer le signal en dehors du voxel. Une homogénéisation du champ magnétique B0 de premier et second ordre a été effectuée au sein

du voxel. Le voxel a été placé de manière systématique dans les NCP de la partie gauche du cervelet en prenant soin d’éviter le tronc cérébral et les lipides sous-cutanés (Fig. 4.2).

Figure 4.2 : Schéma anatomique du cervelet de rat avec la localisation des noyaux

cérébelleux profonds (deep cerebellar nuclei ; DCN) comprenant les noyaux dentelés cérébelleux (dentate nuclei) (issue de Robert et al. 2015).

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4.1.4. Analyse des données IRM et 1_{H SRM in vivo}