Etudes moléculaires

4.1 Extraction d’ADN génomique

4.1.1 Extraction d’ADN génomique de plante

Deux types d’extraction d’ADN ont été utilisés, selon les échantillons de départ. Le premier consiste à extraire l’ADN génomique total à partir de faible quantité de matériel végétal (100 à 150 mg de jeunes feuilles). Le but a été d’obtenir quelques microgrammes d’ADN dans le but de tester quelques marqueurs sur une plante. C’est cette méthode d’extraction qui a été employée afin de déterminer le statut allélique des plantes BC1-S1 et BC2-S1 lors de l’étude de l’effet du fond génétique de la plante sur les gènes majeurs Me3 et

Me1. Le protocole associé, adapté de Fulton et al. (1995), est détaillé en annexe 2. Le

deuxième procédé d’extraction consiste également à extraire l’ADN génomique total d’une plante, mais à partir de beaucoup plus de matériel végétal (2 à 4 g de feuilles). Cette technique d’extraction est utilisée lorsqu’une grande quantité d’ADN par plante est nécessaire, ce qui est généralement le cas lors de la construction d’une carte génétique à partir d’un nouveau croisement. C’est pourquoi on l’a employée pour extraire l’ADN des 130 familles F2 issues du

croisement [YW x DLL]. Le protocole utilisé est décrit en détail en annexe 3. Il a été rédigé d’après Bernatzy et Tanksley (1986) et Michaels et al. (1994).

Après un traitement à la RNAse, la concentration et la pureté de l’ADN extrait ont été mesurées à l’aide d’un spectrophotomètre NanoDrop 2000 (Thermoscientific). Une solution fille à une concentration finale d’ADN de 20 ng/µL a été réalisée afin de normaliser tous les ADN.

4.1.2 Extraction d’ADN génomique de Meloidogyne à partir d’une femelle

Avant toute inoculation d’un essai avec une souche de nématode, une vérification de la nature et de la pureté de cette souche a été réalisée en plus des vérifications routinières (cf. point 4.2.3). Plusieurs techniques d’extraction d’ADN de Meloidogyne sont disponibles. Dans le cadre d’une vérification, la méthode la plus rapide, la plus simple et la plus fiable est l’extraction sur femelle. Elle permet de tester des individus uniques et rend possible la

73 réalisation de plusieurs tests grâce aux quantités d’ADN qu’elle procure. Un protocole détaillé de cette technique est fourni en annexe 4.

4.2 Marquage moléculaire

4.2.1 Détermination du statut allélique d’une plante aux locus Me3 et Me1

SCAR_N est un marqueur codominant lié à Me3 (Fazari et al., 2012) qui permet de déterminer si des plantes sont porteuses de l’allèle conférant la résistance et en combien d’exemplaires. Il a été utilisé afin de discriminer les plantes BC1-S1 homozygotes sensibles (Me3+_/Me3+_{), homozygotes résistantes (Me3/Me3) et hétérozygotes résistantes (Me3/Me3}+_{), à}

la fois dans le fond génétique DLL et YW. Les conditions d’utilisation de ce marqueur (mélange réactionnel, conditions PCR, nature du gel de migration, conditions d’électrophorèse, etc.) sont les mêmes que celles décrites dans Fazari et al. (2012).

En ce qui concerne la détermination du statut allélique d’une plante au locus Me1, on a utilisé le marqueur lié codominant SSCP_PM5 (Fazari et al. 2012). Il a servi à trier les plantes BC2-S1 homozygotes sensibles (Me1+_/Me1+_{), homozygotes résistantes (Me1/Me1) et}

hétérozygotes résistantes (Me1/Me1+_{), aussi bien dans le fond génétique DLL que YW. Le}

marqueur SCAR_CD est un marqueur plus proche encore du locus de Me1 que le marqueur SSCP_PM5 (Fazari et al. 2012). Il est de surcroît plus facile d’utilisation. Cependant, en tant que marqueur dominant, il ne permet pas de faire la distinction entre les plantes homozygotes résistantes (Me1/Me1) et hétérozygotes résistantes (Me1/Me1+_{). Il a donc uniquement servi à}

valider la présence d’au moins un allèle conférant la résistance parmi les plantes BC2-S1 ségrégeant pour Me1.

4.2.2 Génotypage de la population F2 [YW x DLL]

Plusieurs types de marqueurs et de technologies associées ont été utilisés afin de réaliser la carte génétique du croisement [YW x DLL] à partir de 130 individus F2.

Le premier est le marqueur SCAR B94, pour lequel une migration particulière a été réalisée par rapport aux conditions d’utilisation initiales (Djian-Caporalino et al., 2007). En effet, le dépôt des produits PCR a été fait sur gel d’acrylamide 12% horizontal (et non sur gel

74 d’agarose). La migration a été réalisée en TAE 1X, à 100V pendant minimum 6h dans une cuve Elchrom maintenu à 10 °C. Ceci a été fait afin d’être plus discriminant vis-à-vis des bandes obtenues entre YW et DLL.

Le deuxième type de marqueurs utilisés sont des marqueurs microsatellites (ou SSR pour Simple Sequence Repeats), utilisés pour génotyper la collection de piments d’Avignon. Ils ont été sélectionnés pour servir de marqueurs d’ancrage sur la carte car il sont localisés équitablement répartis sur les chromosomes du piment (Yi et al., 2006; Nagy et al., 2007; Portis et al., 2007). De plus, ils ont déjà servi à la réalisation d’autres cartes génétiques du piment (Barchi et al., 2007; Mimura et al., 2012; Sugita et al., 2013). Les conditions PCR sont celles du protocole fourni en annexe 5. Le polymorphisme a été révélé à partir d’un séquenceur ABI 3700 avec comme marqueur de taille du 500 LIZTM _GeneScanTM_{. Le}

génotype des individus a été déterminé à partir du logiciel GenemarkerTM.

Le troisième type de marqueurs exploite des Single Nucleotide Polymorphism (SNP) provenant du criblage d’une core-collection large de piments (Nicolaï et al., 2012). Ils ont été développés à partir de la technique de Hight Resolution Melting (HRMTM_{) suivant les}

recommandations du fournisseur (Biorad). Le génotype des individus a été déterminé à l’aide d’un CFX96TM _(Biorad).

Le quatrième type de marqueur exploite également des SNP, mais à partir de la technologie TaqMan®. Une machine ABI Prism® 7900HT (Applied Biosystems) a servi à déterminer le génotype des individus (Rik van Wijk, communication personnelle).

4.2.3 Identification d’espèces de Meloidogyne

Afin d’identifier les différentes espèces de Meloidogyne, un ensemble de marqueurs SCAR spécifiques a été développé (Zijlstra et al., 2000; Randig et al., 2002). Certains d’entre eux ont servi à s’assurer de la pureté et de l’utilisation de la bonne espèce de nématode avant toute inoculation d’un essai. Il s’agit des marqueurs Inc-K14 (M. incognita), OPA-01 (M.

javanica) et OPA-12 (M. arenaria). Un protocole qui synthétise l’ensemble des informations

nécessaires à l’identification des différentes espèces de nématodes avec ces marqueurs est fourni en annexe 6.

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