2.2) Etude de la stabilité de la molécule signal

II.2.2.1) Etude de la stabilité de la molécule signal à différentes températures de stockage : 15°C, 4°C, -20°C, -80°C

Les études de stabilité ont été menées en parallèle sur des extraits provenant de récoltes de feuilles différentes. Ceci nous a permis de déterminer la variabilité de la quantité de signal extrait en fonction de la période de récolte. Nous avons pris le parti d’exploiter le phénomène d’augmentation de l’activité par digestion brève à la protéinase K, afin d’observer plus aisément les variations d’activité. Toutefois, nous avons étudié un extrait non digéré en parallèle (CE no PK) pour démontrer que dans ces expériences, la protéinase K conserve le même comportement vis-à-vis du signal.

Les résultats sont présentés (figure 9) sous forme d’histogrammes correspondants à l’activité béta-galactosidase (en unités Miller) en fonction de l’échantillon testé. Les récoltes, à partir desquelles les extraits ont été préparés et testés, ont été réalisées les 9 Juillet 2010, 22 Février 2011 et 20 Avril 2011.

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Figure 9 : Etude de l’activité béta-galactosidase (U Miller) d’extraits aqueux préparés à base de feuilles récoltées à différentes dates et conservés à 15°C, 4°C, -20°C et -80°C pendant 1 à 15 jours (1d ; 15d). Echantillons contrôles : sans digestion par la protéinase K (CE no PK).

Dans un premier temps, on peut constater que les trois extraits, différant par la date de récolte des feuilles, ont une activité et un comportement similaire en fonction de la durée et de la température de conservation. On note néanmoins une activité légèrement moins importante pour l’extrait à base de feuilles récoltées en Juillet 2010. Ceci pourrait s’expliquer soit par le fait que les feuilles ont été stockées quasiment 6 mois de plus à -80°C, soit simplement par une quantité un peu moindre de signal produit par les feuilles en été. Globalement, nous pouvons déduire de cette campagne, que l’extraction et la conservation du signal sont répétables d’une récolte à l’autre. Les activités béta-galactosidase des extraits avant ce test de stabilité du signal étaient semblables à celles mesurées pour les extraits conservé à -80°C (à l’erreur près de 100 U Miller).

Les comportements étant similaires, nous avons étudié en détail l’histogramme (figure 10) qui correspond à l’activité moyenne des extraits présentés ci-avant.

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Figure 10 : Etude des activités béta-galactosidase (U Miller) moyennes d’extraits aqueux préparés à base de feuilles récoltées à différentes dates et conservés à 15°C, 4°C, -20°C et -80°C pendant 1 à 15 jours (1d ; 15d). Echantillons contrôles : sans digestion par la protéinase K (CE no PK).

Ce qui se dégage de cette étude, c’est le fait qu’à -80°C l’activité soit bien conservée, quels que soient la durée de stockage et le traitement préalable de l’extrait (digestion enzymatique par la protéinase K ou non).

A 15°C et 4°C, l’activité décroît au cours du temps, et ce plus rapidement à 15°C (perte totale au bout de 6 jours) qu’à 4°C (perte totale au bout de 15 jours). Cette décroissance peut être due à plusieurs phénomènes dont le principal serait une digestion enzymatique des protéines (dont le signal) par les protéases contenues dans l’extrait et/ou par la protéinase K restante. Cependant, l’ajout d’un cocktail d’inhibiteur de protéase dans l’extrait, n’a pas amélioré le résultat. L’inefficacité de l’inhibiteur de protéase vis-à-vis de la perte de signal peut être due la quantité trop importante de protéase en solution ou due au fait que le spectre d’inhibition du cocktail est trop réduit. Cette inefficacité peut aussi s’expliquer par le fait que ce ne sont pas les protéases qui font décroitre l’activité. En effet, de manière plus générale, la stabilité d’une molécule biologique active dans un milieu complexe est rarement très longue, lié au fait même que cette molécule soit un signal. En effet, un signal étant régulé au moment de sa synthèse, il est nécessaire qu’il y ait un dispositif permettant de le dégrader rapidement, s’il n’a pas atteint sa cible.

Ce qui interpelle dans ces résultats, c’est que les activités relevées pour les extraits stockés à -20°C sont remarquablement faibles. C’est pourquoi nous développerons ci-après une étude plus spécifique du comportement de l’activité lorsque l’extrait est stocké à -20°C.

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II.2.2.2) Etude de la stabilité de la molécule signal : cas du stockage à -20°C

Lorsque que l’on congèle l’extrait à -20°C, l’activité béta-galactosidase est faible, alors qu’à - 80°C, l’activité du même extrait est à son maximum. Cela pourrait être dû à la déformation du signal lors de la congélation à cette température, lié au mode de cristallisation de l’eau environnante. On peut également penser que suite à la décongélation, la re-solubilisation soit difficile, toujours à cause du même phénomène de cristallisation (changement de conformation ou d’organisation supramoléculaire).

Afin de déterminer la validité de cette hypothèse, une première expérience a été mise en œuvre. Il s’agissait de congeler de deux façons différentes, des aliquots d’un même extrait, et de suivre la conservation de leur activité, à -20°C, au cours du temps. Une série d’aliquots a été congelée à 77K (-201°C) dans l’azote liquide puis stockée à -20°C, et l’autre série d’aliquots a été congelée et stockée à -20°C.

Le même phénomène de perte d’activité a été observé pour les deux types de congélation (Figure 11). Ce qui laisse penser que la congélation par l’azote liquide n’apporte pas la solution au problème. Toutefois, lors de la trempe thermique à 77K, seule la couche la plus externe de l’échantillon se solidifie rapidement de façon amorphe. Le cœur de la solution, qui se trouve isolée par cette couche de glace, congèle plus doucement et à une température bien supérieure à 77K. Cette congélation lente favorise la formation de cristaux d’eau, qui expliquerait la non conservation du signal en congelant à -20°C ou à 77K.

Figure 11 : Etude des activités béta-galactosidase (U Miller) moyennes d’extraits préparés à base de feuilles récoltées à différentes dates, congelés par trempage dans l’azote liquide (77K), ou directement placés à -20°C (-20°C) puis conservés à -20°C pendant 3 à 14 jours. Ainsi que les échantillons contrôles avec ou sans protéinase K et conservés à -80°C.

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Une troisième voie de congélation a été considérée : la congélation directement à -80°C. Dans tous les essais précédents, la congélation et le stockage à -80°C permettaient de conserver une activité maximale. Forts de cette constatation, nous avons étudié un échantillon congelé à -80°C puis stocké à -20°C. Il s’avère que par cette procédure l’activité est totalement conservée (Figure 12).

Figure 12 : Etude de l’activité béta-galactosidase (U Miller) d’un extrait de Medicago sativa, congelés à -80°C pendant 24h, puis placés à -20°C pendant 1 à 7 jours (1d ; 7d). Ainsi que l’échantillon contrôle conservé à -80°C.

A -80°C, l’eau ne cristallise pas mais se solidifie de façon amorphe (Cooke and Kuntz 1974). Le fait que ce ne soit pas le stockage à -20°C, mais le mode de congélation qui détermine la conservation du signal, montre bien que la cristallisation de l’eau influe sur la qualité de celui-ci (conformation, solubilité). Le but n’étant pas de congeler l’échantillon à -20°C, mais de comprendre pourquoi le signal a disparu, nous n’avons donc pas cherché à protéger le signal pour une congélation directe à -20°C. En effet, l’ajout de glycérol aurait pu permettre de conserver intact notre signal lors d’une congélation à -20°C. Par contre, cet ajout rendrait l’extrait plus difficile à manipuler pour des étapes supplémentaires de purification ou même de caractérisation.

Grâce à ces études de stabilité du signal dans différentes conditions de stockage, les températures utilisées pour les expériences de purification du signal pourront-être mises en place judicieusement et les résultats des tests de présence du signal interprétés plus judicieusement.

Les conditions de conservation du signal et sa nature protéique ont été déterminées. Le signal est stable : lorsqu’il est conservé à -80°C ; congelé à -80°C puis conservé à -20°C ; placé à 4°C pendant moins de 3 jours et à 15°C pendant moins de 2 jours.

Dorénavant, le but de nos expériences sera de le purifier, afin d’en connaitre la structure, la taille, voire les propriétés spécifiques de ce signal.

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