2.1) Détermination de la nature de la molécule signal par différentes digestions enzymatiques

II.2.1.1) Digestion enzymatique de différents extraits de M. sativa par la protéinase K

La protéinase K est une enzyme issue de la moisissure Tritirachium album, qui lyse les protéines et les peptides au niveau des liaisons peptidiques proches d’acide aminés hydrophobes portant des groupements aliphatiques ou aromatiques (Ebeling et al. 1974).

Les résultats de la digestion des extraits de M. sativa par la protéinase K (Figure 6) se sont avérés surprenants. En effet, nous avons remarqué que le temps d’incubation avec l’enzyme et la concentration du signal faisaient varier l’activité du signal dans des sens différents.

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Figure 6 : Histogramme représentant l’activité béta-galactosidase d’extraits de Medicago sativa digérés ou non par la protéinase K (issue de Tritirachium album).

En effet, pour un extrait de feuilles, incubé 1h en présence de protéinase K, l’activité augmente significativement, alors que l’enzyme seule n’est pas active et que l’extrait seul soumis aux mêmes conditions (37°C) présente une activité faible. Pourtant, l’extrait de départ conservé 1h à 4°C reste actif. La perte d’activité serait donc due à la température. Nous remarquons également que lorsque le temps d’incubation usuel de 4h est atteint, l’activité devient très faible. Ce résultat ne permet pas de dire que la protéinase K a digéré le signal, puisque la température joue aussi un rôle sur la perte de l’activité. La forte activité enregistrée pour la digestion à 37°C en 1h, est d’autant plus étrange. Elle pourrait s’expliquer par le fait que la protéinase K libère le signal en digérant des protéines qui s’agrègent autour et/ou des enzymes qui le dégradent.

Lorsqu’une expérience similaire est réalisée avec un extrait de nodule, l’activité disparaît au bout d’1h de digestion et l’activité de l’extrait seul dans ces conditions (1h à 37°C) est conservée (Figure 7). Ce résultat tend à démontrer que la molécule signal est digérée par la protéinase K, et que par conséquent le signal serait une protéine. Cette hypothèse est valable à condition que le signal contenu dans les feuilles et le signal contenu dans le nodule soient de même nature.

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Figure 7 : Histogrammes correspondant aux activités béta-galactosidase des extraits de nodule de Medicago sativa digérés ou non par la protéinase K (issue de Tritirachium album).

L’activité particulièrement forte des extraits de feuille digérés 1h par la protéinase K est une propriété très intéressante pour certaines études. En effet, nous avons utilisé ce phénomène pour l’étude de la stabilité du signal (cf. §II.2.2). Lorsque l’activité de départ est importante, la décroissance progressive est plus visible et donc plus fiable. Nous verrons par la suite que ce phénomène est également un frein à l’étude de la taille de la protéine signal (cf. §II.2.3).

II.2.1.2) Autres digestions enzymatiques

Nous avons également vérifié l’effet des lyses par d’autres enzymes (Figure 8) sur des extraits issus des feuilles.

Dans un premier temps nous avons voulu affiner le résultat précédant en testant l’effet de la digestion de l’extrait par une protéase (protéase d’Aspergillus oryzae) assimilable à une peptidase (Figure 8A) qui clive les peptides et petites protéines au niveau des acides aminés hydrophobes (Rao et al. 1998). Nous avons vérifié que la peptidase seule n’est pas active et que l’extrait seul placé dans les conditions de température de la digestion conserve une bonne activité. Cependant l’extrait perd significativement son activité, après digestion. Le signal est donc dégradé par cette peptidase. Cela confirme le fait que le signal puisse être de nature protéique, même dans l’extrait issu de feuilles.

L’activité et la réactivité de la DNAse et de la RNAse ont aussi été étudiée (Figure 8C et D). Les enzymes seules ne sont pas actives, l’extrait conservé dans les conditions de température et de durée de la digestion conserve son activité. L’extrait digéré demeure actif, après traitement à la DNAse ou à la RNAse, le signal n’est donc pas un acide nucléique.

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Enfin, nous avons voulu éliminer la possibilité que le signal soit un dérivé saccharidique, en étant par exemple une glycoprotéine et que la partie glucidique soit nécessaire à son fonctionnement vis à vis de la cascade AMPc. La digestion par une alpha-glucosidase (Figure 8C) ne semble pas avoir d’effet sur le signal. L’enzyme seule n’est pas active, l’extrait seul dans les conditions de digestion conserve une certaine activité et l’extrait digéré est aussi actif que celui qui ne l’a pas été. Pour s’assurer que l’extrait après digestion contient toujours le signal, nous avons eu recours au phénomène d’augmentation de l’activité béta-galactosidase lorsque l’extrait est digéré 1h à 37°C par la protéinase K. Cet extrait doublement digéré présente une forte activité, donc l’alpha-glucosidase n’a pas digéré le signal, il n’est donc pas de nature glucidique. Une digestion par la béta-glucosidase a été menée, mais le pH auquel l’enzyme est active (pH=5,0), ne permet pas d’effectuer le test d’activité béta-galactosidase. En effet, les bactéries nécessaires au test sont tuées par cette acidité. De ce fait, nous ne pourrons pas avoir la certitude que ce composé ne soit pas de nature glycosidique. Cependant les résultats obtenus avec la digestion enzymatique des protéines semblent indiquer que ce composé pourrait être très probablement de nature protéique. Les diverses expériences exposées par la suite prennent en compte l’hypothèse que ce composé serait de nature protéique.

Les résultats obtenus après ces diverses digestions permettent d’émettre l’hypothèse que le signal est de nature protéique.

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Figure 8 : Activités béta-galactosidase d’extraits de feuilles de M. sativa digérés par différentes enzymes. A) par une peptidase (protéase d’Aspergillus oryzae) ; B) par une DNAse (désoxyribonucléase 1 d’origine bovine) ; C) par une RNAse (ribonucléase A d’origine bovine) ; D) par une glucosidase (alpha-glucosidase de Bacillus stearothermophilus).

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Nous avons remarqué que les extraits seuls dans les conditions de température des différentes digestions enzymatiques perdaient significativement leur activité. De ce fait, nous avons cherché à déterminer les conditions (température, durée des expériences ou du stockage) dans lesquelles nous pouvions travailler pour purifier cette protéine signal. Dans ce but, nous avons procédé à l’étude de la stabilité du signal dans différentes conditions, représentatives des manipulations et/ou du stockage.