C.2.2) Caractéristiques des EPS jouant un rôle pour la bactérie libre

III.C.2.2.1) Propriétés rhéologiques des EPS

Ces propriétés donnent des indications quant au comportement des bactéries dans le sol. Nous avons étudié ici la viscosité et le volume hydrodynamique (par chromatographie d’exclusion stérique (SEC)).

130 III.C.2.2.1.a) Viscosité des EPS

La viscosité relative à été mesurée pour les EPS dissouts dans l’eau à 0,1 g/L (Tableau 2). A cette concentration tous semblent dissouts convenablement (pas d’agrégats visibles à l’œil nu).

Tableau 2 : Viscosité et masse moléculaire des EPS produits par les souches A6 et RHF de R. sullae en fonction de la source de carbone

Souche Source de carbone Viscosité relative des HMW EPS (.10-4) Viscosité relative des LMW EPS (.10-4)

Distribution en masse moléculaire des LMW EPS

A6

Mannitol 1,11 0,91 -

Sucrose 1,03 0,94 45% ≈ 60 kDa et 50% < 2 kDa

Glucose 1,07 0,95 30% ≈ 60 kDa et 40% ≈ 8 kDa

Sorbitol 1,10 0,89 60% ≈ 60 kDa et 30% < 1 kDa

RHF

Mannitol 1,09 0,94 70% ≈ 60 kDa

Sucrose 1,03 0,98 70% ≈ 60 kDa

Glucose 1,11 0,94 50% ≈ 7 kDa et 30% < 1 kDa

Sorbitol 0,96 0,92 75% < 3 kDa

Comme attendu, la viscosité des EPS de forte masse molaire est systématiquement plus importante (<1) que celle des EPS de faible masse molaire (>1), sauf pour R. sullae RHF cultivée avec du sorbitol dont la viscosité relative est inférieure à 1. La viscosité des HMW EPS varie de 1,11 (A6/mannitol et RHF/glucose) à 0,96 (RHF/sorbitol). Pour les EPS plus petits, la viscosité varie de 0,98 (RHF/sucrose) à 0,89 (A6/sorbitol). On constate également que la viscosité n’est pas fonction de la source de carbone, puisque par exemple lorsque la source est du sorbitol, la viscosité relative des HMW EPS est importante (1,10) pour la souche R. sullae A6, alors que la viscosité relative des HMW EPS de la souche R. sullae RHF est la plus faible (0,96).

III.C.2.2.1.b) Distribution en masse moléculaire des LMW EPS

Pour ces expériences de chromatographie d’exclusion stérique la colonne G2000SWxl à été calibrée en masse moléculaire avec pour composés standarts des dextranes de masses moléculaires connues. Après analyse des résultats obtenus, il semblerait que la calibration ne soit pas adaptée, ou que la colonne choisie (dont les caractéristiques sont indiquées pour les protéines globulaires) ne corresponde pas au domaine de masse moléculaire (<10 kDa) adéquat à la séparation résolue des EPS LMW. Les valeurs de masse moléculaire ne sont donc qu’indicatives et non exactes. Cependant, la distribution de masse molaire sera

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certainement conservée, malgré cette erreur de calibration ou de choix de colonne chromatographique.

Cette distribution (Tableau 2) a été déterminée afin de savoir si les populations présentes dans les fractions LMW étaient homogènes. Ce n’est pas le cas, puisque les distributions en masse moléculaire présentent deux types de populations : une à environ 60 kDa et l’autre comprise entre 1 et 8 kDa (A6/sucrose, A6/glucose, A6/sorbitol). Parfois une seule de ces populations est présente : à environ 60 kDa (RHF/mannitol et RHF/sucrose) ou comprise entre 1 et 8 kDa (RHF/glucose et RHF/sorbitol). On peut en déduire que la souche A6 produits deux gammes de taille d’EPS quelque soit la source de carbone, alors que pour la souche RHF, la source de carbone semble influencer la distribution en masse moléculaire des EPS produits.

III.C.2.2.2) Résistance à la sécheresse des souches/source de carbone

Afin de comprendre pourquoi R. Sullae est capable de se développer dans des sols très secs, nous avons étudié la résistance à la sécheresse des différentes souches cultivées sur différentes sources de carbone. Pour cela nous avons observé leur capacité à reprendre une croissance en milieu liquide (DO à 600 nm mesurée au bout de 24h et 48h) après un épisode de dessiccation (Figure 2).

Figure 2 : Histogrammes présentant les densités optiques (DO) à 600 nm mesurée au bout de 24h et de 48h, pour les différentes souches reprises en milieu liquide après une période de dessiccation en fonction de la source de carbone. A6 : Rhizobium sullae A6, F : Rhizobium sullae RHF. Cette expérience a été réalisée par Razika Gharzouli du département de Biochimie microbiologie de l’Université de Mentouri à Constantine (Algérie).

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Après dessiccation, la reprise de la croissance en milieu liquide, au bout de 24h, est meilleure pour la souche Rhizobium sullae RHF, qui résiste donc mieux à la sécheresse que la souche A6. Cette tendance est aussi retrouvée, au bout de 48h, sauf pour RHF/mannitol qui a moins bien repris que la plupart des souches. La meilleure reprise a été enregistrée pour RHF/sucrose et RHF/glucose. Concernant la souche A6, le sucrose est la source de carbone qui a permis la meilleure résistance à la sécheresse. Par contre, cette même souche cultivée dans le sorbitol ne semble pas résister aussi bien à la sécheresse qu’avec les autres sources de carbone.

Le rôle intrinsèque des EPS est de protéger la bactérie des stress abiotiques (Potts 1994), dont la sécheresse. Nous avons cherché à comprendre en quoi les EPS produits permettent à certaines souches de mieux survivre à la sécheresse en fonction de la source de carbone que d’autres.

III.C.2.2.3) Relation entre résistance à la sécheresse, propriété rhéologique et production des EPS

Nous avons déterminé un lien entre la résistance à la sécheresse et la viscosité des EPS et/ou la production et composition de ces EPS.

Dans un premier temps, la présence de désoxyhexoses dans les EPS suggère que la viscosité des EPS pourrait-être renforcée (Meyer et al. 2009 ; Yemmas et al. 2003). C’est pourquoi nous avons recherché une relation entre la composition en désoxyhexose des EPS (Figure 3B) et leur viscosité relative (Figure 3A).

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Figure 3 : Relation entre A) la viscosité relative des HMW EPS et LMW des deux souches R. sullae A6 et RHF, cultivées dans différentes sources de carbone, et B) le taux de désoxyhexose dans la composition mono-saccharidique des EPS.

Pour les EPS de faible masse molaire, la viscosité semble être influencée par la composition en désoxyhexose. A6/glucose et RHF/sucrose font exception, puisque leurs taux de fucose sont respectivement d’environ 30 et 25%. Ces taux ne sont pas les maxima observés pour les EPS des deux souches, pourtant les viscosités relatives des LMW EPS de A6/glucose et RHF/sucrose sont les plus importantes. La viscosité des HMW EPS ne semble pas être influencée par le taux en désoxyhexose. Par exemple, les EPS de forte masse molaire de RHF/glucose et A6/glucose ne présentent pas de fucose, alors que la viscosité globale est plutôt forte. Ainsi, la viscosité serait dépendante en priorité de la taille des EPS (les HMW EPS sont plus visqueux que les LMW EPS). Si la taille des EPS est faible alors le taux de désoxyhexose influence la viscosité.

Le fait que les EPS soient visqueux devrait permettre aux bactéries de mieux résister à la sécheresse. En effet, si l’enveloppe d’EPS est plus visqueuse, elle sera plus cohésive, plus hydratée et la bactérie sera d’autant mieux protégée des variations d’humidité liées à son environnement (Potts 1994). C’est pourquoi nous avons étudié la capacité des bactéries à se

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développer à nouveau après dessiccation (Figure 4B). Dans un premier temps, on constate que la souche RHF résiste mieux à la sécheresse que la souche A6.

En cherchant à expliquer pourquoi certaines souches redémarrent mieux que d’autres dans le milieu liquide selon la source de carbone, nous avons observé une relation avec la quantité d’EPS de forte masse molaire (Figure 4A).

Figure 4 : Relation entre A) le rendement des HMW EPS (en mg/g de culot bactérien sec) des différentes souches étudiées en fonction de la source de carbone, et B) la capacité de ces souches à reprendre leur croissance, au bout de 48h, en milieu liquide, après une période de dessiccation.

En effet, lorsqu’une souche produit une bonne quantité d’EPS de forte masse molaire, la résistance à la sécheresse est importante, c'est-à-dire que la reprise de sa croissance en milieu liquide sera efficace. C’est le cas pour RHF/sucrose et RHF/glucose qui produisent les plus grandes quantités d’EPS de forte masse molaire, parmi les souches qui reprennent le mieux leur croissance au bout de 48h. On retrouve cette relation pour toute la souche A6.

Plus la bactérie produit des HMW EPS, qui sont visqueux, plus son enveloppe sera visqueuse et sa résistance à la sécheresse sera efficace. Nous avons donc établi des relations permettant d’estimer le rôle intrinsèque des EPS, qui sont utiles à la bactérie pour résister à la sécheresse.

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