Chapitre II. Matériels et méthodes
II- 4.2. Etude du rôle des vers de terre dans la mobilité du mercure
La mobilité du mercure a été étudiée lors d’expérimentations en microcosmes en conditions contrôlées (1) dans un sol tropical en présence d’une espèce de vers tropicale et (2) dans un sol tempéré en présence d’une espèce de vers tempéré. Les deux types de microcosmes ont été soumis dans le temps à un ensemble d’analyses : (i) analyse physico-chimique des sols, (ii) quantification du mercure dans les différentes fractions du sol et des turricules (extractions séquentielles), et (iii) bioaccumulation du mercure. Les résultats de ces deux études sont présentés dans les parties V-1 et V-3 du chapitre V.
85 II-4.2.1. Rôle de Pontoscolex corethrurus dans un sol tropical
II-4.2.1.a. Choix et préparation du sol et des vers de terre
Le sol et les vers de terre choisis pour cette étude sont les mêmes que pour le test écotoxicologique présenté précédemment : l’oxisol I échantillonné sur les 20 premiers centimètres du sol sur le site d’étude et l’espèce de ver Pontoscolex corethrurus. La partie superficielle du sol est celle qui accumule le plus de mercure et également celle où se trouvent les vers de terre sur le terrain (Roulet & Grimaldi, 2001; Guedron et al., 2009).
II-4.2.1.b. Mise en place des microcosmes et conditions d’incubation
Deux conditions conditions expérimentales ont été mises en place au laboratoire : (a) des conditions proches de celles rencontrées en conditions naturelles, et (b) en présence d’une forte concentration pouvant être rencontrée sur les sites orpaillés (20 μg Hg g-1
de sol), en présence ou non de vers de terre. Cette concentration de 20 μg Hg g-1 de sol a été fixée suite aux résultats du test écotoxicologique car P. corethrurus n’est pas affecté à cette concentration de mercure que l’on peut cependant retrouver sur des sites d’orpaillage (Durao et al., 2009; Santos-Francés et al., 2011).
Pour chaque traitement, 5 réplicas et 4 dates de prélèvement ont été mis en place : 0, 30, 60 et 90 jours pour chaque traitement (4 traitements x 5 réplicas x 4 dates = 80 microcosmes). Les microcosmes contiennent 500 g d’oxisol (poids sec). Dans les pots plastiques (PP) utilisés, le sol a une hauteur de 5 cm avec un diamètre inférieur égal à 10 cm, et le diamètre supérieur égal à 15 cm. Les sols ont été hydratés à 70% de leur capacité de rétention d’eau (mesurée à 51% d’eau par rapport au poids sec) soit avec 240 ml d’eau soit avec 240 ml de solution HgCl2. Les sols ont été homogénéisés, puis laissés s’équilibrer pendant une semaine avant l’ajout des vers de terre. Les microcosmes ont été maintenus dans le noir dans une salle climatisée à 24 ±1°C pendant 90 jours au total. L’humidité des sols a été ajustée par pesée une fois par semaine.
II-4.2.1.c. Paramètres suivis lors de l’étude en milieu tropical
Différents paramètres ont été suivis au cours du temps: (i) paramètres physico-chimique du sol (pH et COD), (ii) concentrations du mercure dans les sols et dans les turricules (dosage du mercure total, soluble, et extractions séquentielles), (iii) bioaccumulation du mercure dans les vers, et (iv) diversité fonctionnelle et génétique des communautés bactériennes du sol (plaques ECOLOG® et DGGE).
86 Dans les microcosmes en présence de vers, ces analyses ont été effectuées au bout de 0, 30, 60 et 90 jours d’incubation, sur le sol non ingéré et sur les turricules des vers afin de mettre en évidence le rôle des vers dans la mobilité du mercure d’une part et sur la résilience bactérienne d’autre part.
II-4.2.2. Rôle d’Eisenia andrei dans un sol tempéré
Cette seconde étude a été mise en place au laboratoire avec le même objectif d’évaluer l’effet des vers sur la mobilité du mercure dans les sols. Cependant, nous avons voulu évaluer l’impact du ver Eisenia andrei, espèce modèle fréquemment utilisée dans les études écotoxicologiques (OCDE, 2004). Dans cette étude, un sol tempéré a été utilisé afin de travailler avec un sol où cette espèce peut se maintenir, ce qui n’est pas le cas de l’oxisol de notre site d’étude (voir Annexe 7).
II-4.2.2.a. Choix et préparation du sol et des vers de terre
Le sol utilisé pour constituer les microcosmes de cette étude a été échantillonné dans les 20 premiers centimètres d’un jardin biologique situé dans le département de Seine-et-Marne (77). L’espèce de ver utilisée est Eisenia andrei, espèce appartenant au complexe d’espèces Eisenia. Cette espèce est génétiquement uniforme (Cortet et al., 1999), et constitue l'espèce de vers de référence recommandée pour les essais écotoxicologiques au laboratoire (OCDE, 2004), notamment pour son cycle de vie rapide et la facilité d'élevage. Des spécimens adultes ont été fournis par le Pr. Vandenbulcke de l'Université de Lille 1. Ils ont une biomasse moyenne de 0,40 g et mesurent 3 à 4,5 cm. Ils ont été maintenus dans une chambre d’élevage à 20°C dans le noir pour une acclimatation jusqu’au lancement de l’expérimentation.
II-4.2.2.b. Mise en place des microcosmes et conditions d’incubation
L’expérimentation a été mise en place avec quatre traitements : sol seul (S), sol + vers (SV), sol dopé à 20 µg Hg g-1 de sol (SM) et sol dopé à 20 µg Hg g-1 de sol + vers (SMV), avec 3 réplicas et 7 dates de prélèvement : 0, 3, 7, 14, 30, 60 et 90 jours pour chaque traitement. Soit 4 traitements x 3 réplicas x 7 dates = 84 microcosmes (Figure 7).
87 Figure 7. Schéma de la mise en place des microcosmes en conditions de climat tempéré.
Ces microcosmes ont été réalisés dans des pots en polypropylène (PP) de 300 ml dans lesquels ont été ajoutés 250 g de sol sec ramenés à 54% de leur capacité au champ. Pour les microcosmes contaminés au mercure, une solution de HgCl2 a été ajoutée de manière à obtenir une concentration de 20 µg g-1 de sol. Les sols ont été homogénéisés, puis laissés s’équilibrer pendant deux jours. Ensuite, 6 vers de terre ont été inoculés (1,8-2 g de vers de terre par microcosme) dans la moitié des microcosmes. Les microcosmes ont été conservés à l’obscurité à 20°C pendant les 90 jours de l’expérimentation. L’humidité des sols a été ajustée par pesées une fois par semaine.
II-4.2.2.c. Paramètres suivis lors de l’étude en milieu tempéré
Différents paramètres ont été suivis au cours de cette étude: (i) concentrations de mercure dans les sols dopés ou non et en présence ou non de vers (dosage du mercure total, soluble, et extractions séquentielles), (ii) bioaccumulation du mercure dans les vers et (iii) pH du sol. Dans tous les microcosmes, ces analyses ont été effectuées dans le sol après homogénéisation, en présence ou non de vers de terre.
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