5.3. Dosages du mercure

II-5.3. Dosages du mercure

Dans un premier temps, les concentrations totales du mercure ont été déterminées. Ensuite, une extraction à l’eau a été utilisée pour évaluer la mobilité du mercure proche des conditions naturelles (e.g. pluie). Enfin, un protocole d’extraction séquentielle nous a permis de mesurer la répartition du mercure dans les différentes fractions du sol (Silveira et al., 2006). Toutes les concentrations en mercure ont été mesurées par spectrométrie d’absorption atomique (AAS).

II-5.3.1. Principe

Le mercure a été mesuré par absorption atomique à la longueur d’onde de 254 nm. L’analyse consiste en une minéralisation à sec où l’échantillon est porté à 550 °C et tous les produits de la décomposition sont transportés via un flux d’oxygène dans un tube catalytique où le mercure est transformé en Hg° élémentaire qui va s’adsorber sur un piège en or. Le mercure ainsi piégé est réémis par chauffage du piège à 450°C et est quantifié par spectrométrie à absorption atomique. Des standards ont été utilisés comme contrôle : CMR 144 (3.14 ± 0.05 µg Hg g^-1 sol) et BCR 277 (0.128 ± 0.017 μg Hg g^-1).

II-5.3.2. Dosage du mercure total

II-5.3.2.a. Dosage du mercure total dans le sol

Les quantités de mercure total ont été analysées par AMA 254 (Automatic Mercury Analyser). Basé sur le principe de spectrométrie d’absorption atomique (AAS), cet appareil est spécialement conçu pour doser des concentrations faibles en mercure sur des échantillons solides ou liquides (limite de détection : 0,01 ng g^-1). Contrairement à d’autres méthodes de dosage, l’AMA ne nécessite pas de prétraitement des échantillons. Les échantillons solides ont été broyés manuellement à une taille inférieure à 100 μm, dans un mortier en agathe et homogénéisés. Environ 100 mg de solide ont été placés dans une nacelle en nickel et introduits dans l’appareil.

91 II-5.3.2.b. Dosage du mercure total dans les vers de terre

Différents protocoles existent afin de doser les métaux dans les tissus des vers de terre. La plupart proposent une minéralisation complète des vers dans divers acides purs à chaud (Burton et al., 2006; Hobbelen et al., 2006; Udovic & Lestan, 2007, 2010; Ernst et al., 2008). Le mercure étant un métal qui se volatilise à des températures plus basses que les autres ETM, un protocole de dosage sur ver congelé puis lyophilisé a été choisi (Li et al., 2010; Rieder et al., 2013).

Tous les vers de terre analysés ont préalablement été nettoyés avec de l’eau, séchés avec du papier et pesés. Ils ont ensuite été mis sur du papier humide, dans des boites de Pétris pendant 72 heures. Le papier a été changé tous les jours pour éviter la coprophagie. L’objectif est de vider leur tube digestif du sol ingéré, afin de ne doser que le mercure accumulé dans leurs tissus. Ensuite, les vers ont été congelés à -20°C individuellement dans des tubes Eppendorf 2 ml et ensuite lyophilisés à l’aide d’un lyophilisateur pendant 48 heures. Avant analyse, les vers ont été pesés entiers individuellement puis ont été broyés manuellement dans un mortier en agathe jusqu’à obtenir une poudre homogène. Enfin, environ 100 mg ont été pesés dans une nacelle en nickel et analysés directement par AMA 254, comme un échantillon solide.

II-5.3.3. Extractions du mercure dans les sols II-5.3.3.a. Mercure extrait dans l’eau

L’extraction à l’eau est l’extraction la plus simple, et est sensée donner une bonne évaluation des risques de transfert des ETM dans les sols pollués (Lebourg et al., 1996). La méthode utilisée est celle employée par Rasmussen et al. (2000) dans leur étude de l’application de Biosensors Merlux au dosage du mercure dans les solutions du sol. 1 gramme de sol sec a été mis en suspension dans 10 ml d’eau MilliQ® et agité à 300 RPM pendant 15 minutes. Les suspensions ont ensuite été centrifugées à 12 000 RPM pendant 10 minutes. Le surnageant a été filtré à 0,45 µm avec des filtres Teflon PTFE (Minisart SRP 25, Sartorius) et le mercure dissous a été analysé avec l’AMA 254. En attente d’analyse, les échantillons étaient conservés dans des flacons Nalgène© en polypropylène, acidifiés avec de l’acide chlorhydrique HCl 37% jusqu’à pH 1. Afin de minimiser les contaminations, tout le processus d’extraction a été réalisé dans du flaconnage préalablement lavé à l’acide (bains d’acide nitrique HNO3 à 5 %).

92 II-5.3.3.b. Extraction séquentielle du mercure

Il existe de nombreux protocoles d’extractions séquentielles dans la littérature ; la plupart sont basés sur celui de Tessier (1979). Ces extractions sont toujours soumises à de nombreuses controverses, notamment à cause des phénomènes de ré-adsorption. Nous avons néanmoins décidé d’employer un protocole d’extraction séquentielle, plutôt que différentes extractions simples en parallèle pour étudier la répartition du mercure dans les sols. De plus, la plupart des protocoles ne permettent pas de distinguer les ETM liés aux oxydes de fer de ceux liés aux oxydes de manganèse.

Suite à des recherches bibliographiques, le protocole adopté pour étudier la répartition du mercure dans les sols est celui de Silveira et al. (2006) (Tableau 1). C’est un protocole initialement mis en place pour étudier la répartition du Zn et du Pb dans les sols, mais avec une adaptation pour les sols tropicaux. Ce protocole est particulièrement intéressant car les sols tropicaux en général et les oxisols en particulier sont riches en oxydes de Fe et de Mn.

Tableau 1. Protocole de l’extraction séquentielle adopté pour l’étude du mercure dans les sols guyanais (Silveira et al., 2006).

Etapes Fractions Réactifs Conditions d’agitation

I ^{Soluble et}

échangeable ^{7,5 ml 0.1M CaCl2 2h, T°C ambiante} II ^{Absorbé aux}

surfaces ^{15 ml 1M NaOAc (pH 5) 5h, T°C ambiante} III Matière Organique ^{5 ml NaOCl 15% Cl actif}

(pH 8.5) ^{30 min, 90-95°C} IV ^{Oxydes de} Manganèse 15 ml 0.05M NH2OH/HCl (pH 2) ^{30 min, T°C ambiante} V ^{Oxydes de fer} amorphes 15 ml oxalate buffer (pH 3) (0.2M acide oxalique + 0.2M NH4-oxalate) 2h, dans le noir VI ^{Oxydes de fer} cristallins ^{20 ml 6M HCl 24h, T°C ambiante}

VII Résiduelle Culot séché Directement à l’AMA

Le protocole de Silveira et al. (2006) a été comparé lors d’expérimentations au protocole de Han et al. (2006) qui est lui adapté au mercure. Les résultats obtenus lors de cette phase de mise au point ont montré que le premier donne les meilleurs rendements d’extractions pour les sols guyanais étudiés pendant cette thèse. Ce protocole a donc été retenu mais avec une légère modification. La fraction résiduelle est obtenue directement par analyses du mercure

93 total restant dans le culot (AMA 254) plutôt que par digestion à l’eau régale. Toutes les autres fractions ont été analysées selon le protocole original.

Après chaque extraction, le mélange est centrifugé à 1225 g pendant 10 minutes, et le surnageant est prélevé. Ensuite, le culot est lavé avec 5 ml de NaCl à 0.1 M, agité à la main et centrifugé à 1225g pendant 10 minutes. Le surnageant est prélevé et ajouté au surnageant préalablement pipeté. Ce volume est filtré avec des filtres PTFE avec une membrane de 0.45µm et acidifié avec du HCl 37% à pH 1 pour conservation (à 4°C) jusqu’au dosage à l’AMA. A chaque fois, les culots sont séchés pour les étapes d’extractions suivantes. A la fin de l’extraction, la fraction résiduelle est mesurée directement à l’AMA dans le culot séché.